Свойства эмали: 1.Свойства и физиологическое значение эмали зуба.

. Это означает, что, в отличие от более ранних отчетов, длинная ось каждого нанокристалла не обязательно совмещена с кристаллической осью c , они могут быть на 90 ° друг от друга. Это интригует, поскольку исследования ПЭМ показали, что кристаллы в стержнях эмали выровнены своими длинными осями вдоль оси стержня ^15,16,17 . Кристаллы апатита вытянуты параллельно друг другу в эмалевых стержнях, как показано на обеих криотрещенных эмали на дополнительном рис.1 и протравленной эмали на рис. 3 и дополнительном рис. 2, как ранее было показано во многих других экспериментах и ​​схемах ^14,27,51,52 . Они постепенно меняют ориентацию от головы к хвосту, как показано на рис. 1 и 2, и ранее предполагалось многими авторами на основе изображений SEM ^25,26,27 .

Сравнение SEM-изображения и PIC-карты одной и той же области человеческой эмали. a SEM-изображение, полученное после травления, показывает два хорошо различимых стержня, разделенных меж стержневыми и более глубокими бороздками и окруженных другими частичными стержнями. b PIC-карта показывает, что одни и те же два хорошо разных стержня имеют внутри себя несколько ориентаций, как и все другие стержни, изображенные в этой работе. Поскольку нижняя часть имеет более разнообразную ориентацию, мы выбрали этот стержень для дальнейшего увеличения в ( c ) и ( d ), где белые прямоугольники расположены в ( a ) и ( b ) соответственно. c Увеличенное изображение SEM, показывающее, что все кристаллы приблизительно горизонтальны и параллельны друг другу. d Увеличенная карта PIC, показывающая, что кристаллы сверху донизу прямоугольника меняются от красного до оранжевого, до зеленого в верхней половине, что составляет угол 60 °, и от красного до пурпурного в нижней половине, что составляет угол 30 °.См. Дополнительные рис. 4 и 5 для точного положения этой области в зубе и для деформации изображения SEM, необходимой для точного перекрытия нижнего стержня на карте PIC. Из-за этого перекоса верхний стержень неточно соответствует верхнему стержню на карте PIC

Визуализация точно такой же области эмали с помощью PIC-картирования и SEM до и после травления, соответственно, с одинаковым увеличением и ориентацией показывает, что кристаллы вытянуты параллельно друг друга в значительной степени неправильно ориентированы.Два изображения, представленные на рис. 3, по-разному искажены двумя микроскопами, но они явно сделаны из одной и той же области зуба. Кристаллы в стержне, которые по-разному ориентированы почти на 90 °, то есть с зелеными и пурпурными пикселями на карте PIC на рис. 3d, кажутся все примерно горизонтальными и выровненными параллельно друг другу на SEM-изображении на рис. 3c.

Хотя можно утверждать, что изображение, полученное с помощью SEM, показывает, что кристаллы не совсем параллельны друг другу, очень маленькие отклонения в ориентации кристаллов намного меньше, чем большие (> 30 °) разориентации оси c , показанные на карту PIC.Основываясь на изображениях с большим увеличением на рис. 3c, d, ясно, что карты PIC показывают большой угловой разброс в ориентациях оси c , который не соответствует аналогичному изменению направления удлинения на изображениях SEM.

Поскольку обычно кристаллы ГАП растут вдоль оси c , предполагается, что кристаллы эмали также следуют этой схеме роста, однако карты PIC демонстрируют явное свидетельство гораздо большего углового разброса по сравнению с светлопольным ПЭМ эмалевых стержней.Консенсусная модель предполагает соориентацию длинной оси и оси c , что понятно, поскольку кристаллы эмали в основном изучались методом дифракции электронов в ПЭМ из ограниченных областей, где (0,0, \ (\ ell \) ) отражения обнаруживаются только в том случае, если кристаллы имеют свою ось c , перпендикулярную электронному пучку, в пределах ± 1 ° ¹⁶ . Следовательно, единственными кристаллами, ориентацию которых можно было проиндексировать, были кристаллы, у которых оси c лежали в плоскости в образце ПЭМ и вдоль стержней, поэтому анализ был сильно искажен в сторону этой интерпретации.При отображении PIC все ориентации осей c одинаково обнаруживаются, поэтому перекоса не происходит. Тщательный повторный анализ предыдущей работы TEM ^17,21 показывает, что действительно наблюдаемые здесь угловые разброса наблюдались раньше. Различная ориентация кристаллов в стержне согласуется с разной электронной плотностью соседних кристаллов в ПЭМ, наблюдаемой Selvig ²¹ , что может быть связано с дифракционным контрастом на кристаллах с различной ориентацией. Эти данные не были интерпретированы как разные ориентации, поскольку были возможны другие интерпретации, включая различную толщину или другие артефакты секционирования.На нынешних картах PIC все кристаллы просто отполированы, поэтому ожидается, что их ориентация останется такой же, как и на нетронутой эмали. Они сделали в вышеупомянутых карбонатных биоминералах ^{45,46,47,48,49} . Множественные ориентации, наблюдаемые в каждом стержне при картировании PIC, также полностью соответствуют изолированным изогнутым кристаллам эмали, наблюдаемым Daculsi et al. извлечено из эмали плодов человека ¹⁹ . Чтобы подтвердить наблюдения PIC-картирования, мы провели HR-TEM тонких срезов зрелой эмали и обнаружили, что оси c кристаллов в непосредственной близости друг от друга в объеме 130 нм × 130 нм × 100 нм неправильно ориентированы из-за 23 °, 27 ° и где-то между 18 ° и 90 ° (рис.4). Эти наблюдения HR-TEM полностью согласуются с результатами картирования PIC и, таким образом, подтверждают их.

Ориентация кристаллов тонкого среза внутри стержня внешней эмали человека показывает разориентацию оси c на 23 °, 27 ° и> 18 °. — микрофотография HR-TEM, сделанная из объема 130 нм × 130 нм × 100 нм внутри внешнего эмалевого стержня, с кристаллами, вытянутыми в плоскости сверху вниз в ( a ) (далее обозначены как вертикальный ). b Анализ быстрого преобразования Фурье (БПФ) всего изображения в ( a ), показывающий, что два кристалла в этом объеме имеют неправильную ориентацию осей c на 27 °. e , f Спектры мощности БПФ, извлеченные из ( c ) и ( d ) в ( a ), которые включают кристаллы с почти параллельными и вертикальными плоскостями (100). В e и f красные кружки и стрелки обозначают (002) расстояния и направления оси c-, соответственно; синие кружки и синие стрелки обозначают (100) расстояния и направления осей a — соответственно.БПФ ( e ) указывает на присутствие монокристалла карбонизированного апатита с осью c , ориентированной на 5 ° по часовой стрелке от вертикали, и осью a, под углом 90 ° от оси c , как и ожидалось. для апатита. БПФ ( f ) указывает на наличие двух перекрывающихся кристаллов, f ₁ и f ₂ . a — ось кристалла f ₁ горизонтальна (синий кружок). Полосы решетки (001) не были обнаружены для f ₁ , поэтому его ось c находится вне плоскости изображения в ( a ). c — ось кристалла f ₂ ориентирована под углом 18 ° против часовой стрелки от вертикали (красный кружок). Полосы решетки (100) не были обнаружены для f ₂ , поэтому его ось a находится вне плоскости изображения в ( a ). Кристалл f ₂ ориентирован своей осью c на 18 ° против часовой стрелки от вертикали, таким образом, угол между осями c кристаллов f ₁ и f ₂ составляет не менее 18 °, но он может достигать 90 °.Оси c кристаллов e и f ₂ отстоят друг от друга на 18 ° + 5 ° = 23 °. Поскольку кристаллы эмали имеют в среднем 26 нм × 63 нм в поперечном сечении ¹⁸ , кристаллы шириной 30 нм в центре изображения ( a ) должны быть ориентированы почти с ребра. Поскольку этот участок имеет толщину 100 нм, все три кристалла, идентифицированные в БПФ, находятся либо в непосредственной близости, либо непосредственно примыкают друг к другу. Таким образом, оси c кристаллов в непосредственной близости друг от друга составляют 23 °, 27 ° и где-то между 18 ° и 90 °.На дополнительном рис. 5 показано, где образец зуба был подвергнут FIB-обработке для извлечения этого тонкого среза.

Большая область внутренней эмали, показанная на рис. 2, была объединена и смешана из 3 × 2 частично перекрывающихся карт PIC, полученных с разрешением 60 нм. Как и на рис. 1, все стержни на рис. 2 имеют значительный угловой разброс. Рисунок перекрестия — это механизм структурного упрочнения, ответственный за устойчивость эмали к росту трещин ^4,27,32 . В схеме перекреста, наблюдаемой на рис. 2, стержни в поперечном или продольном сечении показывают ориентацию кристаллов в красно-черном или голубо-синем диапазонах цветов, как и ожидалось для стержней, которые расположены примерно перпендикулярно друг другу.

Внутри каждого стержня на рис. 1 и 2 можно часто наблюдать удлиненные нанокристаллы, ориентированные под углом до 30 ° от их непосредственно прилегающего кристалла, как показано на рис. 1c, и очевидные внутри каждого стержня на рис. 2. Мы подчеркиваем, что наблюдаемые нарушения ориентации внутри стержней являются не из-за изменения направления удлинения стержней в схеме перекреста: в этом случае ориентация осей кристалла c действительно изменилась бы от стержня к стержню, но внутри каждого стержня все кристаллиты должны быть соориентированы, но они не .Их никогда не бывает, ни в одной из анализируемых областей по всему слою эмали и по двум разным молярам. Точно так же мы не сосредотачиваемся на известном и хорошо зарекомендовавшем себя постепенном смещении кристаллов, наблюдаемом на SEM, от стержня к стержню (также известному как от головы к хвосту в каждом блоке замочной скважины ) ^25,26,27 , но на кристалле c -смещение осей внутри каждого стержня (головки). Удлиненные нанокристаллы внутри каждого стержня морфологически параллельны друг другу, как показано ранее с помощью SEM и AFM ^22,23,24 , а также по данным SEM на рис.3, дополнительные фиг. 1 и 2. Их кристаллографическая ориентация, однако, сильно различается, вплоть до 90 ° поперек стержня (головки). Это означает, что ось c в некоторых случаях может быть перпендикулярна направлению удлинения нанокристаллов.

Угол между осями c , который распространяется внутри каждого стержня, никогда не равен нулю и варьируется от 30 ° до 90 °, как показано во всех областях, проанализированных в этой работе, все из которых суммированы на дополнительных рисунках. 3 и 5.

Неправильная ориентация соседних кристаллов как механизм упрочнения

Мы предполагаем, что неправильная ориентация соседних нанокристаллов эмали обеспечивает механизм упрочнения.Если все кристаллы соориентированы, поперечная трещина может распространяться через границы раздела кристаллов, тогда как если кристаллы неправильно ориентированы, трещина в основном распространяется вдоль границ раздела кристаллов, что приводит к упрочнению материала за счет механизма отклонения трещины, представленного на рис. 5.

Неправильная ориентация кристаллов обеспечивает механизм упрочнения. a Схема механизмов: соориентированные кристаллы (синий цвет) позволяют трещинам распространяться по разным кристаллам именно потому, что они соориентированы.Когда кристаллы неправильно ориентированы (цвета), вместо этого трещины отклоняются на границах раздела кристаллов, поэтому они не могут распространяться или расти на большие расстояния, а материал становится более жестким. b Молекулярно-динамическое моделирование границ зерен, где кристаллы гидроксиапатита смещены на 0 °, 14 ° или 47 °. Обратите внимание, что трещина, начинающаяся снизу, распространяется прямо через границу раздела 0 °, отклоняется на 14 ° и снова не отклоняется на границе раздела 47 °. См. Дополнительные видеоролики 1, 2, 3

Подобный механизм наблюдался в металлах после сильной пластической деформации, когда границы под большим углом делают металлы прочными, пластичными, усталостными и прочными ⁵³ .В металлах, однако, были задействованы дислокации и скольжение на границах зерен ^53,54,55 , которые могут происходить или не происходить в эмали. Предлагаемая нами модель упрочнения проще, поскольку в ней используются только ориентации кристаллов, которые можно прямо и однозначно наблюдать.

Моделирование молекулярной динамики (МД) поддерживает модель, предложенную на рис. 5a. Результаты представлены на рис. 5b и дополнительных видеороликах 1, 2, 3 и полностью описаны в дополнительных сведениях и дополнительных рисунках.6–10 и дополнительные таблицы 1–3. Кристаллы подвергались давлению в вертикальном направлении 1 ГПа, которое сравнимо с давлением, которое испытывают кристаллы ГАП во время жевания, при условии, что сила жевания 1000 Н и площадь бугорка зуба составляет 1 мм ² . Во всех трех случаях кристаллы спекались при давлении 1 ГПа. Два спеченных кристалла в дальнейшем называются бикристаллами. Конечно, на некоторых межкристаллических поверхностях есть следовые количества воды и белков. Они были специально опущены в нашем моделировании, так как хорошо известно, что на границах раздела таких неоднородных материалов трещины обычно отклоняются ^47,56,57 .Открытие здесь заключается в том, что на границах раздела один и тот же материал отклоняется от трещин, при условии, что кристаллы ориентированы по-разному. Коблишка-Венева и др. не наблюдали никакого неапатитового материала на границах зерен в своей дифракции обратного рассеяния электронов (EBSD) эмали, что подтверждает нашу интерпретацию, что такие материалы редко встречаются в эмали ⁵⁸ . Таким образом, моделирование показывает распространение трещины через совместно ориентированные границы раздела двух кристаллов или отклонение из-за неправильно ориентированных границ раздела двух кристаллов без воды или белков.

Присутствие дефектов решетки апатита и замещений может повлиять на структуру кристаллитов и, следовательно, на механический отклик кристаллов при моделировании МД. Они были опущены, чтобы модель оставалась максимально простой и информативной.

Что самое интересное и неожиданное, моделирование показывает, что трещины ведут себя по-разному в зависимости от угла неправильной ориентации. Когда кристаллы на границе зерен соориентированы ( θ = 0 °), трещины распространяются через границу раздела, когда их оси c смещены на 14 °, трещины отклоняются, но при 47 ° неверно. -ориентация трещина снова распространяется по границе раздела.Этот результат был воспроизведен в нескольких моделированиях с использованием однородной и неоднородной нагрузки в горизонтальном направлении, и поэтому заслуживает внимания, хотя и был неожиданным.

Мы количественно определили критическую скорость высвобождения энергии ( G _c ) (которая, несмотря на это общепринятое название, является плотностью в пространстве, а не скоростью во времени), также известной как энергия разрушения, по кривым напряжения-деформации. на дополнительном рис. 10А путем их интегрирования для оценки общей внешней работы, необходимой для разрушения всей бикристаллической системы (деформация ε ≈ 0.2) ⁵⁹ . Мы использовали этот энергетический подход, потому что бикристаллы, используемые в нашем моделировании, не являются однородными системами. Полученная критическая скорость выделения энергии составляет около 5,87 Дж / м ² для соориентированных бикристаллов ГАП ( θ = 0 °), что соответствует вязкости разрушения K _IC = 0,88 МПа · м ^0,5 (с использованием модуля Юнга E ≈ 133,3 ГПа), что хорошо согласуется с таковым для исходного ГАП, измеренным с помощью наноиндентирования, который составляет K _ICexper = 0.65 ± 0,14 МПа · м ^{0,5 60} . Критические скорости высвобождения энергии для бикристаллов с отклонением ориентации θ, = 14,1 ° и θ = 47 ° увеличиваются до 8,6 и 7,4 Дж / м ² , соответственно (подробности см. В методах SI). Таким образом, результаты нашего МД-моделирования количественно показывают, что энергия, необходимая для разрушения бикристаллов, значительно увеличивается с ~ 6 до ~ 9 и обратно до ~ 7 Дж / м ² при наличии неправильно ориентированных границ раздела.

Небольшие (1

Если действительно, как предполагает моделирование методом МД, небольшие углы неправильной ориентации более эффективны при отклонении трещин, чем большие углы, существует ли угол отклонения . пятно угол неправильной ориентации, который максимизирует выделение энергии? Другие углы неправильной ориентации не могли быть протестированы с помощью моделирования MD из-за периодических ограничений граничных условий (см. SI).Предполагая, что долгая эволюционная история эмали могла быть выбрана для такого золотого пятна, если оно существует, эксперимент по проверке его существования прост: измерение неправильной ориентации осей c в соседних пикселях на картах PIC. Гистограммы на Рис. 6 и Дополнительный Рис. 11 демонстрируют, что большинство пикселей неправильно ориентированы на 1 ° относительно своих соседних пикселей, и все они неправильно ориентированы на <30 ° (Рис. 6). Следовательно, это может быть золотая середина, то есть кристаллы, расположенные на расстоянии 1–30 ° друг от друга, могут максимально увеличить выделение энергии и упрочнение.

Гистограммы угловых расстояний кристаллических c -осей. Угловые расстояния в трехмерном пространстве между осями c в каждых двух соседних 60-нм пикселях, измеренные во всех пикселях на рис. 2. Почти все угловые расстояния ниже 30 °, а пик — на 1 °. На дополнительном рисунке 11 показаны дополнительные гистограммы, полученные через каждые 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 или 256 пикселей, демонстрирующие, что ориентации постепенно меняются от пикселя к пикселю, таким образом, от кристалла к кристаллу во всех компонентах эмали.Небольшие шипы около 30 °, 40 °, 45 °, 50 ° и 60 ° соответствуют границам раздела стержень-меж стержень без органической оболочки.

Примечательно, что все кристаллы в стержнях эмали человека слегка смещены относительно своих соседних кристаллов, так как показано гистограммой на рис. 6. Несколько сильно неправильно ориентированных соседних пикселей, например 60 °, встречаются на границах стержень-междупержень, где большинство неправильно ориентированных кристаллов разделены органической оболочкой (неполяризационно-зависимой и, следовательно, черной на картах PIC), и лишь некоторые из них нет, создавая небольшие всплески на гистограммах Инжир.6 и дополнительный рис. 11. Модель и моделирование, представленные здесь, предсказывают, что при сильно неправильно ориентированных границах зерен не происходит прогиба трещин, поэтому отклоняющие трещины органические оболочки ^47,56,57 , расположенные на границах стержень-межшток, необходимы для упрочнения материал.

Модель метода конечных элементов (FEM) на дополнительном рис. 8 также подтверждает, что малые углы лучше: деформация растяжения ниже при 14 °, чем при неправильной ориентации 0 ° или 47 °, и напряжение в вершине трещины под нагрузкой. , менее концентрирован при 14 °, чем при отклонении от 0 ° или 47 °.

Все наблюдаемые изменения ориентации являются постепенными, как показывают данные на рис. 6: при выборке соседних пикселей искажения небольшие (1–30 °, рис. 6), затем они увеличиваются с увеличением расстояния выборки (дополнительный рис. 11). ).

Зигзагообразный излом на дополнительном рис. 1D качественно показывает механическое преимущество неправильной ориентации кристаллов в эмалевых стержнях. Наноструктурированные материалы ^61,62 и прогиб трещин на неправильно ориентированных границах раздела ограничивают распространение трещин ^63,64 .

Отклонение трещин — это хорошо зарекомендовавший себя механизм упрочнения ⁶⁵ , поэтому мы заключаем, что наблюдаемые искажения в эмали играют ключевую механическую роль: они увеличивают прочность эмали в наномасштабе, что принципиально важно для противостояния мощным воздействиям. жевательные силы, приближающиеся к 1000 Н, повторяемые тысячи раз в день ² .

Предыдущие исследования поведения эмали при разрушении выявили другие механизмы упрочнения, такие как микротрещины, отклонение трещин и разветвление в масштабах больше, чем размер кристаллитов внутри стержня ^66,67 .Таким образом, все предыдущие модели фокусировались в основном на роли границы раздела белок-стержень или выравнивания стержней, всегда предполагая, что кристаллиты внутри стержней были выровнены и соориентированы, и, таким образом, их можно рассматривать как гомогенные ^68,69 . Точно так же эффект гидратации или содержания белка, о котором сообщалось ранее ⁷⁰ , играет роль в более крупном масштабе.

Тот факт, что в человеческих зубах не часто наблюдаются переломы поперек стержней, а в первую очередь на микромасштабной границе раздела стержень-стержень ⁶⁷ , демонстрирует, что предложенный здесь наноразмерный механизм упрочнения эффективен.

Неправильная ориентация, наблюдаемая внутри всех стержней, может быть результатом несовершенного ориентированного прикрепления ранее кристаллических наночастиц ⁷¹ , которые могут быть наночастицами, наблюдаемыми после травления или травления замораживанием с помощью атомно-силовой микроскопии в эмали человека ⁷² и недавно предложено Робинсоном и Коннеллом ⁷³ для зарождения более крупных кристаллов, наблюдаемых в зрелой эмали человека. Моделирование методом МД точно показывает, что приложение жевательного давления (1 ГПа) к соориентированным или неправильно ориентированным кристаллам заставляет кристаллы плавиться (спекаться).Следовательно, происходило ли слияние кристаллов во время формирования эмали, как было предложено Робинсоном и Коннеллом, или после того, как зуб прорезался и начал жевать, не имеет отношения к функции. Важно то, что кристаллы в какой-то момент слились, а затем слились по мере жевания зуба.

Межстержневые кристаллы сориентированы (0

В отличие от стержней, межстержневые кристаллы преимущественно соориентированы на больших площадях эмали, как показано почти однородным зеленым оттенком на рис. .1 и 2 и независимо от осей стержней. Есть только несколько пикселей, в которых стержень имеет другую ориентацию. Одним из таких исключений является центральная область на рис. 2, где оси стержней перпендикулярны плоскости изображения, а ориентация кристалла между стержнями — желтая (+ 60 °), а не зеленая (+ 30 °). Эмаль между стержнями долгое время считалась непрерывной фазой на основании совмещения ее апатитовых волокон, наблюдаемого на изображениях SEM ^13,74,75,76 . Все карты PIC на рис.1, 2, 3, 7, дополнительные рис. 3, 4, 5, 12 показывают, что не только кристаллиты между стержнями выровнены, но и их оси c сильно ориентированы. Это подтверждает, что термин , непрерывная фаза, , использованный предыдущими авторами ¹³ для промежуточного стержня, был точным. Почти соориентация всех стержней становится еще более удивительной, если учесть, что каждая клетка амелобласта откладывает один комплекс стержень-стержень с головкой и хвостом (H и T на Рис. 1b) ⁷⁷ . Все хвосты образуют соединенный, соориентированный континуум между стержнями, таким образом, многие клетки амелобластов должны координировать отложение между стержнями на обширных территориях.Анализируя весь слой эмали, который составляет 4 мм под бугорком зуба на дополнительном рис. 3, мы обнаружили, что одинаковая ориентация стержней сохраняется от внутренней к внешней эмали, с несколькими пикселями немного разных цветов, от апризматической эмали (рис. 7) на поверхности через внешнюю, среднюю и внутреннюю эмаль, которые показаны на дополнительном рис. 3.

Апризматическая эмаль на поверхности бугорка зуба . Обратите внимание, что апризматическая эмаль неотличима от промежуточного стержня, у нее просто нет стержней (ранее называемых призмами, откуда и произошло название этого апризматического слоя).См. Дополнительный рис. 3 для точного положения этой области в зубе. PIC-карта апризматической эмали , показывающая, что почти все кристаллы зеленые, поэтому их ось c ориентирована под + 30 °. b — f СЭМ-изображения той же области после травления. b SEM-изображение с точно таким же увеличением, что и PIC-карта в a , с пурпурными стрелками, указывающими отверстие в поверхности зуба, пропитанным эпоксидной смолой, которая сопротивляется травлению, и двумя стержнями.Стрелки на рисунках и указывают на те же элементы до травления. c СЭМ-изображение той же области при меньшем увеличении. Стрелки были уменьшены вместе с изображением и указывают точно такие же особенности. d — f Увеличенные изображения протравленной апризматической эмали. Синяя стрелка на панелях b — f указывает на особенность, видимую на всех изображениях SEM и хорошо разрешенную в d — f . Панели e и f ясно показывают, что все кристаллы выровнены параллельно друг другу и перпендикулярно поверхности зуба.На панели и это показано как направление удлинения , которое составляет -36 ° от вертикали. Их зеленый цвет в b указывает на ориентацию оси c на + 30 ° от вертикали (также показано на e ), таким образом, оси c отстоят на 66 ° от направления удлинения, или 24 °. кроме поверхности зуба. Таким образом, кристаллические оси c приблизительно параллельны, а не перпендикулярны поверхности зуба. Дополнительный рис.12 показывает больше PIC-карт апризматического слоя в другом зубе, подтверждая, что кристаллические оси c ориентированы случайным образом относительно поверхности зуба

В другом зубе от другого молодого взрослого человека (дополнительные рис.5 и 12) мы обнаружили две ориентации стержня, каждая из которых простирается на 2/3 или 1/3 толщины эмали 1,7 мм под бугорком. Опять же, апризматическая эмаль на поверхности сориентирована с соседними кристаллами между стержнями на дополнительном рис. 5, как и кристаллы между стержнями на рис. 1, 2 и дополнительный рис. 3.

Апризматические кристаллы эмали ориентированы случайным образом

Апризматическая эмаль должна иметь оси c , перпендикулярные поверхности зуба. Это явно не относится к двум разным зубам от разных доноров, как показано на рис.7 и дополнительный рис. 12, где оси c составляют + 30 ° и -60 °, соответственно, то есть параллельны и 30 ° от поверхности бугорка зуба. Чтобы исключить артефакты отображения PIC, на дополнительном рис. 12 мы представляем PIC-карты второго зуба, установленного в двух положениях, повернутого на 90 °. После травления в той же области апризматической эмали, представленной на рис.7, кристаллы действительно выглядят перпендикулярно поверхности зуба, как ранее наблюдалось ²⁷ и как показано на рис.7, но их оси c почти параллельны, а не перпендикулярны поверхности зуба. Это не общая ориентация, на самом деле в апризматической эмали на дополнительном рис. 12A, B мы видим c — ось ~ 30 ° от нормали к поверхности зуба, ~ 0 ° от нормали на дополнительном рис. 12d. –I и ~ 66 ° от нормали на рис. 7. Таким образом, ориентация оказывается совершенно некоррелированной с ориентацией поверхности.

Ориентация кристаллических осей c , наблюдаемая на рис.7 удивительны, потому что все кристаллы параллельны друг другу и расположены перпендикулярно поверхности ²⁷ , поэтому ожидалось, что их оси c также будут перпендикулярны. Однако их случайная ориентация согласуется с данными, уже представленными на рис. 2 и 3, где все стержни имеют внутренний угол разброса от 30 ° до 90 °, поэтому удлинение кристаллов перпендикулярно их оси c больше не должно быть неожиданным. Интересно, что и твердость, и жесткость поверхности имеют максимальные значения ⁷⁸ , и, по крайней мере, в случае рис.7, максимумы H и E происходят по осям c , а не вдоль них, как предполагалось ранее.

Ограничения для будущих моделей формирования эмали

Наблюдение за тем, что промежуточный стержень совмещен на миллиметровых расстояниях, тогда как стержни удлиняются в разных направлениях и внутри них имеют различную ориентацию, обеспечивает сильное ограничение для любой модели формирования эмали. Никакая современная модель образования эмали не может описать, как слой связанных клеток амелобластов, каждый из которых откладывает 1 стержень и 1 стержень, может достичь этой геометрии.

Кристаллическая ориентация промежуточного стержня должна быть установлена ​​один раз в DEJ, а затем распространяться через растущий меж стержневой эмалевый слой либо без изменений, либо изменяться редко. По крайней мере, три процесса роста минералов могут привести к окончательному соориентированному промежуточному стержню: аморфные предшественники фосфата кальция, наблюдаемые в эмали мыши ⁷⁹ , с прикреплением частиц, управляемым белком, как показано Fang et al. in vitro ⁸⁰ , или ионно-ионное осаждение кристаллов эмали, как описано Tomson et al.in vitro ⁸¹ , или путем формирования нанолент из шаблона амелогенина для сборки кристаллов апатита, как предложено Хабелицем ⁸² . В любом из этих случаев события зарождения кристаллов между стержнями должны происходить крайне редко. Кроме того, органические молекулы различаются стержнем и стержнем во время формирования минерала эмали ^83,84 , что, возможно, вносит свой вклад в наблюдаемые здесь различия ориентации.

Несовпадение оси c и направления удлинения наблюдалось во всех кристаллах, в стержнях, промежуточных стержнях и апризматической эмали, иногда даже на 90 °.Последний случай не означает, что кристаллы растут в направлении оси a или оси b . Похоже, что ориентация кристалла во многих случаях не коррелирует с направлением удлинения, поэтому кристаллы могут быть ориентированы в любом направлении по мере их роста. Это согласуется с двумя различными механизмами образования: (i) рост кристаллов через фазу-предшественник аморфного фосфата кальция ⁷⁹ , при этом кристаллическая фаза распространяется через аморфную фазу и за счет нее, или (ii) рост кристаллов за счет несовершенно ориентированного присоединения. ранее кристаллических наночастиц ⁷¹ .В обоих случаях органическая матрица должна осуществлять значительный контроль над ростом кристаллов, чтобы преодолеть термодинамические ограничения, определяющие габитус кристалла.

Сравнение эмали мыши и человека

Эмаль режущего края мыши также анализировали с помощью PIC-картирования Stifler et al. ³⁵ . Сравнивая его с эмалью человека, мы наблюдаем, что в эмали мыши ориентация оси c и направления удлинения не совпадают. Однако во внутренней эмали мыши каждый стержень имеет единственную ориентацию, особенно вблизи DEJ.Однако, двигаясь от середины внутренней эмали к внешней эмали мыши, стержни становятся постепенно менее однородными в ориентации оси кристалла c и демонстрируют частые постепенные изменения ориентации.

Все представленные здесь данные дают исчерпывающее и подробное представление о структуре эмали и строго ограничивают трехмерную геометрию формирования эмали человека. Кристаллы в апризматической и межстержневой эмали сильно соориентированы по всей толщине эмалевого слоя, тогда как в стержнях они немного неправильно ориентированы (0–30 °) по отношению к непосредственно соседним кристаллам и значительно (30–30 °). 90 °) поперек штанги в любой ориентации.Угловой разброс внутри стержня никогда не наблюдался равным нулю.

Эти данные показывают ранее упускаемые из виду механизмы ужесточения неправильной ориентации, действующие в человеческой эмали, наиболее важном биоминерале для укусов и жевания, и, следовательно, для питания и выживания Homo sapiens . Эта структура, ранее скрытая, способствует тому, что эмаль становится чрезвычайно эластичной, поскольку она выдерживает сотни циклов жевания в день с сотнями ньютонов силы укуса. Эта структура предотвращает катастрофическое разрушение эмали за счет отклонения трещин внутри стержней и сохраняет ее работоспособность в течение всего срока службы.Эмаль и ее кристаллическая структура хорошо сохранились в летописи окаменелостей ^8,85 , поэтому путь для будущих открытий — это сравнение структурной эволюции эмали во времени и сопоставление ее с известными изменениями образа жизни и питания. В более широком смысле, сравнение структур эмали у млекопитающих может исследовать корреляции между структурой и функцией. Еще одно направление — изучить, насколько широко распространены механизмы упрочнения неправильной ориентации в биоминералах и горных породах, и как их можно применить к синтетическим материалам.

Зубная эмаль — обзор

11.1.1.2 Рост октакальцийфосфата в амелогенине

Амелогенины составляют развивающийся внеклеточный матрикс эмали зуба в качестве основного белкового компонента матрикса эмали [1,2,30,31]. Систематические исследования сборки амелогенина показали, что наносферы являются основной структурной единицей геля амелогенина [32,33]. Поскольку кристаллы эмали образуются в матрице эмали, состоящей в основном из амелогенинов, предполагается, что эти наносферы играют существенную роль в контроле образования и организации кристаллов эмали [34–36].

Используемые амелогенины представляют собой экстрагированные нативные бычьи, рекомбинантные мышиные амелогенины полной длины (rM179) и сконструированные амелогенины, лишенные гидрофобного С-конца (rM166). Амелогенины крупного рогатого скота содержали около 40% 20,7 кДа и более мелкие компоненты: 3–8, 13, 16 кДа [29,37]. Рекомбинантные мышиные амелогенины, rM179 и rM166, были получены группой доктора Дж. М. Олдака, как описано ранее [38,39]. Для сравнения использовали бычий альбумин, желатин, агарозу, полиакриламид.

СЭМ-изображения типичных ленточных кристаллов ОКП, выращенных без добавок (контроль), представлены на рис.11.2. На рис. 11.3 показаны СЭМ-изображения кристаллов ОСР, выращенных в 10% rM179, 10% rM166, полиакриламидном геле, 10% желатине, 10% альбумина и 0,5% агарозе. В целом размер этих кристаллов был намного меньше, чем у контрольного кристалла ОСР. Основная ленточная морфология кристаллов ОСР была однозначно модифицирована амелогенинами. В присутствии rM179 и rM166 кристаллы имели стержнеобразную или призматическую морфологию, что необычно для кристалла OCP. Подобная морфология наблюдалась для кристаллов ОСР, выращенных в присутствии 10% экстрагированного бычьего амелогенина [29].Наблюдение с помощью СЭМ при большем увеличении показало, что боковая поверхность этих кристаллов была покрыта адсорбатом (рис. 11.4). Поскольку азот был обнаружен из адсорбата на кристалле с помощью энергодисперсионного рентгеновского микроанализатора (EDX), был сделан вывод, что амелогенин адсорбируется на боковой поверхности кристаллов [29]. С другой стороны, в присутствии других материалов стержневидные или призматические кристаллы не наблюдались; вместо них наблюдались узкие и длинные пластинчатые кристаллы. На рис. 11.5 показаны XRD-профили кристаллов, выращенных без добавок (контроль на рис.11.5) и в присутствии 10% экстрагированного бычьего амелогенина, 10% rM179 и 10% rM166. Профили XRD показали характерные пики (100), (200) и (010) ОСР, соответственно, при 4,7, 9,4 и 9,7 градусах в 2 θ . Таким образом, кристаллы были идентифицированы как OCP.

Рисунок 11.2. СЭМ-изображения кристаллов ОСР, выращенных без добавки. (A) x1000, (B) x6000 и (C) x30 000. OCP , октакальцийфосфат.

Рисунок 11.3. СЭМ-изображения кристаллов ОСР, выращенных в присутствии 10% rM179, 10% rM166, 10% полиакриламидного геля, 10% желатина, 0.5% агарозный гель и 10% альбумин. OCP , октакальцийфосфат.

Рисунок 11.4. СЭМ-изображение с большим увеличением кристаллов ОСР, выращенных в присутствии 10% rM179. Обратите внимание на адсорбенты на боковой поверхности кристаллов. OCP , октакальцийфосфат.

Рисунок 11.5. Профили XRD кристаллов, выращенных в отсутствие амелогенина (контроль) и в присутствии 10% экстрагированного бычьего амелогенина, 10% rM166 и 10% rM179. OCP , октакальцийфосфат.

Длина ( L ), ширина ( W ) и толщина ( T ) кристаллов ОСР, полученных в отсутствие и в присутствии этих добавок, приведены в таблице 11.1. В целом длина и ширина кристаллов были уменьшены амелогенинами и другими добавками, в то время как уменьшение толщины было довольно небольшим. Отношения этих кристаллов L / W и W / T (рис. 11.6) показывают общую особенность влияния амелогенинов на рост кристаллов ОСР. Соотношение между пластинчатым кристаллом OCP и кристаллографическими осями ( a , b и c ) показано на рис. 11.6A.Отношение L / W (рис. 11.6B) эффективно увеличивалось с помощью rM179, rM166 и желатина. Хотя влияние экстрагированного бычьего амелогенина на соотношение L / W (рис. 11.6C) было небольшим, его соотношение W / T было почти таким же, как у rM179 и rM166. Стержневидная и призматическая морфология кристаллов, выращенных в присутствии бычьего амелогенина [29], также указывает на влияние бычьего амелогенина на уменьшение отношения W / T .

Таблица 11.1. Длина ( L ), ширина ( W ) и толщина ( T ) кристаллов октакальцийфосфата, полученных в отсутствие (контроль) и в присутствии добавок, и степень измельчения, представленная как L / Lc , W / Wc и T Отношение / Tc . Lc , Wc и Tc — это размер контрольных кристаллов.

PAA , Полиакриламид.

Рисунок 11.6. (A) Взаимосвязь между гранями кристалла, кристаллографическими осями и L , W , T кристалла OCP. (B) L / W и (C) W / T соотношение кристаллов ОСР, выращенных в отсутствие (контроль) и в присутствии экстрагированного бычьего амелогенина, rM179, rM166, PAA, желатина, альбумин и агароза. OCP , фосфат октакальция; PAA , полиакриламид.

Для обозначения степени уменьшения размера соотношение L / Lc , W / Wc и T / Tc ( Lc , Wc и Tc — размер контрольных кристаллов) приведены в таблице 11.1. Эти значения показали, что амелогенины подавляли рост ОСР в порядке W ( b -направление оси)> L ( c -направление оси)> T ( a -направление оси).Эти значения также указывают на степень взаимодействия амелогенинов с гранями (010), (001) и (100) кристалла ОСР. Амелогенины сильно взаимодействовали с гранью (010), затем с гранью (001) и довольно слабо с гранью (100). Таким образом, степень взаимодействия с амелогенинами была порядка (010)> (001)> (100) граней. Это свойство было специфическим для амелогенинов по сравнению с другими используемыми материалами [29,40–42].

Дозозависимая модификация морфологии кристалла ОСР с помощью бычьего амелогенина, rM179 и rM166 [41] четко продемонстрировала специфическое взаимодействие между гранью (010) кристалла ОСР и амелогенинами.На рис. 11.7 представлены СЭМ-изображения кристаллов ОСР, выращенных в 1%, 5% и 10% rM166. Ширина кристаллов ОСР уменьшалась с увеличением концентрации rM166. Рост ОСР в 10% желатиновом геле без и с 0,125–2% свиного амелогенина [43] показал удлинение кристаллов, вызванное амелогенином. Отношение L / W увеличилось с 3,5 (при 0,125% амелогенина) до 19,4 (при 2% амелогенина). Это также указывает на специфическое взаимодействие амелогенина с лицевой стороной (010) ОСР, которое вызвало более быстрый рост в направлении оси c .Следует отметить, что использованный свиной амелогенин содержал около 7,4% полноразмерного P173, 10,7% P161 и 50% P148 [32]. Следовательно, наносферы амелогенина в целом реагировали как гидрофобные белки [44].

Рисунок 11.7. СЭМ-изображения кристаллов ОСР, выращенных (A) без rM166, в присутствии (B) 1% rM166, (C) 5% rM166, (D) 10% rM166. OCP , октакальцийфосфат.

Наблюдалась тенденция амелогенина к реакции с гранью (010) кристалла ОСР, независимо от типа используемых амелогенинов, то есть нативный или рекомбинантный, с гидрофильным С-концом или без него.Это указывало на то, что способ взаимодействия был обычным среди этих амелогенинов. Согласно аминокислотной последовательности амелогенинов [34], молекула амелогенина имеет три характерных участка: N-концевую область, богатую тирозином, центральную сердцевинную область, которая характеризуется высоким содержанием гидрофобных аминокислот, и кислую гидрофильную C -терминальный регион. Поскольку основная часть этих молекул амелогенина является гидрофобной, наиболее вероятным фактором, регулирующим взаимодействие, является гидрофобность [29].Тот факт, что уменьшение толщины, вызванное rM166, было почти таким же, как и rM179, подтверждает это. Основываясь на аминокислотном составе и гидрофобности каждой аминокислоты [45], теоретическая pI N-концевой и центральной области составляла 6,8 [29]. Следовательно, при pH раствора 6,5 предполагается, что молекулы амелогенина заряжены положительно. Более того, сообщалось, что самоорганизующийся амелогенин формирует частицы нанометрового размера с диаметром от 5 до 70 нм [38]. В 35% геле свиного амелогенина наносфера амелогенина в диапазоне от 8 до 200 нм составляет основную строительную единицу [32].Хотя размер сборки меняется в зависимости от условий решения, он намного больше, чем элементарная ячейка кристалла OCP [19,20]. Следовательно, когда наносферы амелогенинов взаимодействуют с кристаллом ОСР, они, как предполагается, распознают общие свойства граней кристалла, а не некоторые конкретные реакционные центры в элементарной ячейке [29,46].

Исходя из кристаллической структуры OCP [19,20], грань (010) не обнажает молекулу воды и имеет отрицательную выпуклую область, тогда как грань (100) обнажает молекулы воды и положительный заряд.Было высказано предположение, что количество экспонированных молекул воды и заряд лица связаны с взаимодействием с наносферами амелогенина [29]. Гидрофобные наносферы амелогенина будут реагировать преимущественно с гранью (010), в то время как они будут реагировать менее активно с гранью (100) (рис. 11.8B1). Таким образом, палочковидные или призматические ОСР росли в присутствии 10% амелогенинов (рис. 11.8С1). С другой стороны, в 10% полиакриламидном геле, 10% желатине, 10% альбумине и 0,5% агарозном геле росли плоские и длинные пластинчатые ОСР (рис.11.8C2). Полиакриламид, желатин и агар известны как гидрофильные материалы. Альбумин представляет собой глобулярный белок, который сворачивает молекулу так, что гидрофобные области находятся внутри, а гидрофильные — снаружи. Следовательно, эти материалы, вероятно, действовали как гидрофильные. Как показано на рис. 11.8B2, гидрофильные материалы могут предпочтительно реагировать с гранью (100) и меньше реагировать с гранью (010), что приводит к пластинчатой ​​морфологии (рис. 11.8C2). Эти режимы взаимодействия проиллюстрированы на рис.11.8.

Рисунок 11.8. Схема взаимодействия добавок с гранью (100) и (010) кристалла ОСР. (A) грани (100), (010) и (001) исходного кристалла OCP. (B) Взаимодействие (B1) амелогенина и (B2) желатина, альбумина, агарозы и полиакриламида с предпочтительной кристаллической поверхностью. (C) Морфология кристаллов, выращенных в (C1) амелогенине и (C2) других материалах. OCP , октакальцийфосфат.

В другой экспериментальной системе [47] влияние рекомбинантного свиного амелогенина (rP172) на образование кристаллов фосфата кальция изучали с использованием срезов эмали (третьи моляры человека) и буферного раствора Трис-HCl (2.58 мМ [Ca], 1,55 мМ [PO ₄ ], pH 7,6) при 37 ° C. Концентрация rP172 составляла 5, 20, 70 и 100 мкг / мл. Через 16 ч реакции на срезе эмали перпендикулярно росли короткие пластинчатые кристаллы. Рост кристаллов подавлялся rP172. В растворах 5 и 20 мкг / мл пластинчатые кристаллы стали немного меньше контрольных кристаллов. В растворах 70 и 100 мкг / мл пластинчатые кристаллы укорачивались, а край кристаллов искривлялся. Поскольку XRD продуктов проводили в диапазоне 2 θ от 10 до 60 градусов, было невозможно идентифицировать эти кристаллы как OCP.

Механические свойства нанокомпозита эмали

Для взрослых индийских премоляров мы впервые сообщаем об одновременной оценке нанотвердости, модуля Юнга и вязкости разрушения нанокомпозита эмали. Нанотвердость и модули Юнга оценивались от начала средней области эмали до 10 мкм м от дентино-эмалевого перехода (DEJ) и в области дентина с использованием техники наноиндентирования. Вязкость разрушения от около середины области эмали до около зоны DEJ измеряли с использованием техники микроиндентирования.Деформацию изучали с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) и автоэмиссионной сканирующей электронной микроскопии (FESEM). Относительные различия в степени биоминерализации в областях эмали и дентина были изучены методом энергодисперсионного рентгеновского излучения (EDS). Были проанализированы вариации прочности эмали в зависимости от прочности фазы белковой матрицы, который показал, что прогнозируемое значение ударной вязкости белка, присутствующего в нанокомпозите, было сопоставимо с таковым для других биопротеинов, описанных в литературе.Кроме того, работа разрушения, оцененная по измеренному значению ударной вязкости эмалевого нанокомпозита, хорошо согласуется с экспериментальными данными, приведенными в литературе.

1. Введение

Tooth — это натуральный биокомпозитный материал на основе фосфата кальция с микроскопической функциональной степенью (рис. 1). Кроме того, зуб также имеет иерархическую архитектуру, например, от макроструктуры к микроструктуре и наноструктуре (рис. 1). Зуб состоит в основном из твердой эмали, более пластичного дентина и мягкой соединительной ткани, пульпы зуба.Эмаль — самая твердая структура в организме человека, содержащая примерно 95 мас.% Гидроксиапатита (ГАП). С другой стороны, дентин обладает пористой структурой и состоит из 70% неорганического материала (т. Е. ГАП), 20% органических материалов (т. Е. Коллагенового волокна) и 10% воды по весу. Микроструктура эмали показывает различную ориентацию плотно упакованных призм или стержней эмали. Эти стержни инкапсулированы органическим белком, называемым эмалевой оболочкой. Кроме того, призмы или стержни состоят из наноразмерных кристаллов неорганического ГАП с различной ориентацией внутри.С другой стороны, дентин имеет коллагеновую матрицу, армированную нанокристаллом HAP, который сохраняется как слой за слоем. Композитное ложе дентина также имеет дентинные канальцы и канальные микроструктуры, которые поставляют питание от области пульпы к коронковой части зубов. Напротив, поверхность стыка эмали и дентина (DEJ) имеет куполообразные выемки. Следовательно, нерегулярный интерфейс сцепляет две ткани, например, эмаль и дентин. Поверхность соединения дентиноэмалевого нанокомпозита (DEJ) сильно зубчатая и имеет ямки, в которые неглубокие углубления дентина входят в круговой выступ твердого эмалевого нанокомпозита, таким образом заставляя эмалевый нанокомпозитный колпачок прочно держаться на дентине [1].В результате жевания окклюзионная область нанокомпозита эмали и проксимальные точки контакта испытывают изменяющуюся скорость нагрузки. Во время высокой окклюзионной нагрузки в области нанокомпозита эмали могут образовываться трещины, но они редко распространяются через DEJ в дентин и разрушают весь зуб. Сообщается, что DEJ на 75% менее прочен, чем дентин, и в 5-10 раз прочнее, чем нанокомпозит эмали [2]. Белковый компонент зуба помогает поглощать большую часть деформации и рассеивать дополнительную энергию [3].Хорошо известно, что DEJ представляет собой тонкий слой, свойства которого меняются от области дентина до области нанокомпозита эмали. Дентинные волокна заканчиваются в месте соединения, где начинают проявляться кристаллиты ГАП, демонстрирующие характеристики эмалевого нанокомпозита [4].