Сложные рисунки по клеточкам: Сложные рисунки по клеточкам ? фото 100 креативных идей

Содержание

Рисунки по клеточкам сложные — сможет нарисовать любой!

Красиво рисовать — могут единицы! А тем, у кого нет особенных способностей – о рисовании остается только мечтать! Ну и любоваться чужими рисунками, конечно же! Еще совсем недавно – так и было! Но теперь – все изменилось, потому что с помощью клеточек любой из нас сможет нарисовать красивую картину! Да-да! Рисунки по клеточкам сложные и большие – ничем не уступают по красоте настоящим картинам!

В детстве многие мечтают стать настоящим художником! Это же так здорово – рисовать красивые рисунки, дарить их своим друзьям и близким! Увы, не всем даны способности и таланты, поэтому чаще всего, в будущем приходится выбирать совсем другие профессии! А на красивые картины – любоваться на выставках! Но сегодня – все изменилось. И нарисовать их сможет каждый! Ведь теперь есть картинки по клеточкам!

Отсчитав нужное количество клеточек и закрасив их в определенный цвет, вы сможете нарисовать красивый портрет, пейзаж, любимого персонажа или целый сюжет! Вам потребуется немало терпения и внимательности, но результат того стоит! Для больших рисунков лучше всего подойдет миллиметровая бумага, но можно использовать и обычные листы в клетку, склеив их в один большой лист! Хотите попробовать нарисовать настоящую большую картину?

С помощью клеточек можно нарисовать все, что угодно. В тетради или блокноте – небольшие рисунки цветов, животных или любимых персонажей, на большом тетрадном листе – красивую композицию, а на листе миллиметровой бумаги – даже огромный натюрморт или портрет! Все зависит только от сложности выбранного вами образца для перерисовки. Конечно, начинать сразу с огромных картин – не стоит, но если постараться, можно очень быстро перейти от самых простых картинок к гораздо более сложным!

Более сложные рисунки подойдут тем кто уже натренировался на маленьких и простых рисунках по клеточкам, и желает попробовать нарисовать что-то более сложное. В нашей галерее представлены как портреты так и и просто классные рисунки по клеточкам для срисовки в тетради.

Для более сложных рисунков лучше подойдёт миллиметровая бумага.

В Живую это выглядит примерно вот так:

А здесь вы можете заказать классный портрет с использованием технологии флип-арт.
Технология флип-арт , это рисование с использованием красок и трафарета.

Рисунки по клеточкам сложные – образцы для перерисовки

Post Views: 15 164

Рисунки по клеточкам для начинающих в тетради, простые, сложные и 3D схемы

Вам нравится Япония? Вы любите разгадывать кроссворды?Должно быть, Вы думаете: «К чему все эти вопросы? Так вот! Японцы обожают разгадывать кроссворды, и в основе их лежит рисование по клеточкам. Если правильно разгадать кроссворд, то получаются очень интересные рисунки.

Освоить процесс рисования по клеточкам сможет почти каждый. Для этого вам не нужно оканчивать художественную школу или иметь особый талант рисования. Просто будьте креативным! Приступим!

От простого к сложному

Для лёгкого и быстрого обучения приобретите тетрадь в клеточку, простой карандаш и фломастеры.Просто наглядным способом перенесите рисунки в тетрадь.

Если Вы новичок – используйте готовые схемы, а когда научитесь этому процессу – придумывайте свои идеи!

Шаблоны

Лицо человека

Что может быть прекраснее, чем лицо человека? Создайте портрет своими руками и наслаждайтесь Вашим творением!

Фрукты

Такие сладкие и полезные! Когда мы смотрим на них, у нас поднимается настроение, и наш организм хочет получить свою долю витаминов.

Сердце

Самый популярный рисунок – наш «мотор жизни», который ассоциируется с прекрасным чувством любви.

Другие идеи

Вы можете рисовать по клеточкам домашних питомцев, машины, сладости, дома, город, цветы, флаги разных государств, буквы и многое другое…

Реализуй творческие способности! Рисунки в формате 3D!Это прекрасный способ интересного досуга. Учёными доказано, что во время рисования нервная система человека успокаивается, развивается мышление, улучшается память и сосредоточенность.

Создавайте яркие и насыщенные рисунки, добавляйте краски в свою жизнь! Таким интересным рисунком можно украсить интерьер, создать аппликацию или порадовать друга своим подарком!

Как Рисовать Накрашенные Губки по Клеточкам ♥ Рисунки по Клеточкам

Watch this video on YouTube

красивые, интересные, легкие и сложные рисунки в тетрадь

Большую популярность в последнее время набирает рисование по клеткам. Чтобы вы всегда знали, что нарисовать и часами не искали новые идеи, мы приготовили картинки для срисовки по клеточкам. Раньше такие изображения чаще встречались в схемах для вышивки, а сейчас украшают тетради для рисования. Эти «пиксельные» изображения стали востребованы как у детей, так и у взрослых. С помощью пикселей создаются интересные картины с символами, животными, предметами и людьми.

Рисунки по клеточкам

Срисовывать рисунки по клеточкам не сложно. Так как все представленные картинки черно-белые, вам понадобится простой карандаш и тетрадь или листик в клетку. Затем выбирайте любой понравившийся рисунок, внимательно на него смотрите и начинайте поэтапно срисовывать.

Рисунки для срисовки по клеткам, которые мы отобрали очень разные. Среди них много животных, мультяшных персонажей и даже портрет. И если вам сложно представить, как это выглядит нарисованным по клеточкам, посмотрите на эти красивые картинки и убедитесь, что весьма оригинально и необычно.

Нарисованные картинки по клеточкам украсят ваши тетради и превратят их в художественные альбомы, главное не рисуйте в школьных тетрадях и на уроках, учителя не оценят вашу тягу к прекрасному.

Рисуя красивые рисунки по клеточкам с детьми, вы будете развивать у ребенка логическое мышление, внимание и аккуратность. А заодно и математику захватите, высчитывая где и в какой строке нужно рисовать.

На первый взгляд кажется, что все очень просто, считай, да рисуй. Так и есть, только нужно проявлять аккуратность и следовать строго по схеме. Упустив или переместив один квадратик, может потеряться правильность всего изображения.

Легкие рисунки по клеточкам

Для начинающих kakrisovat.com подготовил самые простые рисунки карандашом для срисовки по клеточкам. Они очень легкие и содержат в себе лишь контур изображения. Поэтому вы точно сможете нарисовать их, а потом перейти к более сложным рисункам.

Здесь главное понять принцип и сразу не запутаться в большом количестве квадратиков. Тогда срисовки пойдут легко, будете создавать несколько за один вечер. Конечно первое время вы можете постоянно искать для срисовки карандашом легкие картинки и только когда будете уверенны в себе на все сто, перейдете на сложные в перерисовывании изображения.

Мы собрали картинки разной сложности, так что вам будет куда расти и развиваться. Можете выбрать любой рисунок и проверить свои силы художника уже сейчас. Запасайтесь тетрадями, карандашами, ластиком и точилкой, мы знаем, что вас затянет и остановится будет трудно.

Рисунки по клеточкам. Сложные и легкие!

Дорогие пользователи, а так же гости нашего сайта VilingStore, сегодня мы с вами рассмотрим технологию рисования рисунки по клеточкам.

Наверное, каждый из нас закрашивал клеточки на полях школьных тетрадей. У кого-то из этого всего получались интересные орнаменты, кто-то писал таким образом тексты, но далеко не всем известна технология рисования рисунков по тетрадным клеточкам, которую мы рассмотрим в этом уроке.

Что такое рисунки по клеточкам?

Рисунки по клеточкам это вид изобразительного искусства, в котором используется пиксельная (точечная) графика. В зависимости от сложности такого изображения увеличивается его площадь и количество пикселей (в нашем случае – клеток), которые закрашиваются. Чем больше будет площадь изображения, тем выше будет реалистичность изображения при осмотре с дальнего расстояния.

Какой след рисунки по тетрадным клеткам оставили в истории?

Безусловно, каждый из нас, чьё детство прошло в 80-е или 90-е, даст ответ на этот вопрос. И ответ на него простой – видеоигры!

Все мы помним легендарные игры из нашего детства: Марио, «танчики», Pacman, Donkey Kong и многие другие. Об этих играх знают и наши дети, но в курсе ли они, что Марио не всегда был трёхмерным?

В наше детство игры были 8-битными, и даже самые красочные пейзажи составлялись по технологии пиксельной графики. Используя эту же технологию, рисуются рисунки по тетрадным клеткам. И кто знает, может быть, легендарный Марио или Donkey Kong тоже когда-то были просто рисунками на полях школьной тетради?

Давайте и мы с вами попробуем нарисовать наш первый рисунок по тетрадным клеткам, и кто знает, может быть, он вдохновит вас на что-то такое, что перевернёт наш мир, как когда-то его перевернуло появление видеоигр.

Что необходимо для рисования простых рисунков по тетрадным клеткам?

Для рисования простых рисунков по клеткам нам понадобятся:

Чёрная гелиевая ручка
Фломастеры
Тетрадь (или тетрадный лист) в клетку

Как нарисовать простой рисунок по тетрадным клеткам?

В рисовании простых рисунков по тетрадным клеткам нет ничего сложного. Всё что вам нужно – посчитать клеточки, начертить контур и закрасить рисунок в соответствии с оригиналом. Давайте рассмотрим это подробнее на примере сердечка.

Возьмите тетрадный лист и чёрную гелиевую ручку, поставьте три крестика так, как это показано на рисунке. Крестики будут означать то, что эти квадратики мы будем закрашивать чёрным цветом.
Далее нарисуйте линии, которые обозначат границы нашего рисунка в этой области.
Поставим ещё 6 крестиков сверху, по три крестика с каждой стороны. Обратите внимание на отступы, считайте клеточки, которые нужно оставить пустыми.
Проведём ещё 2 линии, чтобы обозначить границы рисунка.

5. Поставим ещё по крестику слева и справа, а так же проведём горизонтальную линию под верхними крестиками, обозначая границы в этом месте. Сделайте это так, как показано на рисунке.

6. Проставим 8 крестиков по вертикали, по 4 крестика с каждой стороны, так как это изображено на следующем рисунке.

7. Проведём вертикальную линию слева, а так же линии сверху, так как это сделано на рисунке. Этим мы полностью обозначим верхнюю границу нашего сердечка.

8. Далее обозначим крестиками нижнюю часть сердечка слева. Посмотрите на рисунок, чтобы убедиться, что вы всё делаете правильно.

9. И сделаем то же самое с правой половиной сердечка.

10.Теперь нам осталось обозначить границы сердечка по всему его периметру, так как это сделано на рисунках ниже. Наш рисунок уже напоминает сердечко, однако, это ещё не всё. Теперь мы должны закрасить наше сердечко, чтобы оно приобрело готовый вид.

11. Закрасим внутреннюю часть сердечка красным фломастером, но оставим три клеточки белыми в левом верхнем углу, дабы обозначить световой блик. Сделайте это так, как это показано на рисунке.

12. Последнее, что нам осталось сделать – это закрасить чёрным фломастером те части, которые мы помечали крестиками.

И вот, наш рисунок приобрел свой готовый вид. Теперь вы умеете рисовать простые рисунки по тетрадным клеточкам и можете попробовать свои силы в рисовании других картинок, которые можно без труда найти в интернете по ключевым словам «8bit art».

Очень легкие рисунки по клеточкам для детей, 6 лет, 5 лет, 7 лет, 12 лет, для 1 класса, фрукты, гравити, животные, простые и сложные

Каждый из нас в душе чуть-чуть художник. Мы всячески стремимся разукрасить свой мир. А что, если человек совсем не умеет рисовать, как быть? Рисование по клеточкам не только полезное и увлекательное занятие, но и очень доступное и понятное увлечение. В такой технике довольно просто создать любой рисунок, даже состоящий из сотен тысяч клеточек. Еда, цветы, животные, сердечки и смайлы – это лишь маленький перечень всевозможных рисунков. Для создания работы достаточно освоить технику нанесения узора по номерам. Перед вами огромная коллекция тематических рисунков, которые под силу создать детям разных возрастов.

Содержание статьи

Рисунки по клеточкам для 5 лет

Привлекать пятилеток к графическим диктантам можно после того, как они научились держать ручку в руке и умеют считать до 10. Занятие очень увлекает, ведь ребенок просто считает клеточки и в конце получает готовую картинку. Таким образом, тренируется память, внимательность и вырабатывается усидчивость. Работы можно разукрасить карандашами или заштриховать. Для творчества понадобится лишь ластик и карандаш.
Лучше всего, чтобы ребенок сам выбрал понравившееся изображение и попытался перенести его на бумагу. Примеры рисунков обычно даются с описанием последовательности и направлением движения. Первые работы можно создавать вместе с родителями.

Любой рисунок начинают с точки отчета (метки). Именно от нее будет идти направление линий. Так как малыш еще путается в сторонах, для облегчения задачи просто указывают стрелочки.

Рисунки по клеточкам для 6 лет

Шестилеткам следует слегка усложнить задачу. Пусть они зеркально срисовывают сам рисунок, постепенно изображая вторую половинку. Можно добавить движение не только вверх или вниз, но и наискосок. Родителям следует помнить, что такое занятие для малышей лишь игра, а не обучение. Не стоит ругать их за ошибки, а лучше поддержать и сохранить добрый настрой.

Рисунки по клеточкам для 7 лет

В этом возрасте ребенок уже четко знает направление вверх-вниз, влево-вправо. Он может без помощи родителей справится самостоятельно с простым графическим рисунком.

Более сложные рисунки для семилеток желательно разделить на дополнительные квадраты (10х10 клеток).

Рисунки по клеточкам для 1 класса

Немного освоив клеточное рисование можно переходить к цветовому оформлению своих работ.

Рисунки по клеточкам для девочки 12 лет

Пиксель арт – вот такое название имеет необычная забава рисования по клеточкам. Это отличный способ для девочек самоутвердиться. Не каждая из них умеет красиво рисовать, но пиксельное рисование поможет перенести на бумагу видение мира и проиллюстрировать их мысли. Доказано, что такое рисование помогает сосредоточиться и успокоиться, а также развивает чувство цвета.

Для подростков близка тема рисования кошечек, мишек, бабочек и отношений с мальчиками.

Рисунки по клеточкам фрукты

Познание окружающего мира обычно начинают из ярких и сочных фруктов. Это способствует быстрому запоминанию названий предметов и развитию образного мышления. Рисование по клеточкам очень затягивает, ведь в конце обязательно получается оригинальный рисунок. Единственное, что нужно учесть при таком занятии — это правильный подсчет клеточек.

Рисунки по клеточкам Гравити

Героев известного мультсериала «Гравити Фолз» можно также перенести на бумагу при помощи клеток. Сам сериал впервые нам показали в 2012 году, а второй сезон вышел четыре года назад. Близнецы Диппер и Мейбел на летних каникулах приезжают в гости к дяде Стэну. Он живет в маленьком городке Гравити Фолз, где происходят загадочные и таинственные события.
Сами герои имеют приятную, запоминающуюся внешность. Изобразить их можно при помощи готовых схем. Некоторые рисунки довольно большие, поэтому для них понадобится разворот листа.

3D рисунки по клеточкам в тетради

Создавая 3D рисунки, необходимо понимать игру света и тени. Именно благодаря им, работа имеет замысловатые формы и несет в себе реалистичность. Клеточки будут служить специальной разметкой и помогут сохранить нужные пропорции.

Трехмерная лестница

Поэтапные шаги создания такого шедевра размещены здесь.

Конечно, чтобы научиться создавать шедевры нужна практика. Используйте для этого приведенные ниже примеры и заготовки.

Рисунки по клеточкам маленькие и красивые

Маленькие несложные рисунки можно создавать в дороге или сидя в очереди. Детям очень нравятся мультяшные супергерои, животные или просто абстрактные работы.

Очень легкие рисунки по клеточкам

Хорошей идеей для перерисовывания служат смайлики, различные сладости, цветочки и милые животные.

Рисунки по клеточкам в тетради животные:

Дети очень любят изображать на своих рисунках животных, хотя они не всегда хорошо получаются. Упростить работу можно при помощи клеточек. Достаточно зарисовать их в нужных местах и сохранить определенные пропорции.

кошки

На одних схемах кошки выглядят как настоящие, а на других — они мультяшные. Но в обоих случаях, они игривые и ласковые.

пони

Пони, особенно если они пришли к нам из Понивиля, веселые и забавные. Их отличительной чертой является маленький рост, красивая пышная грива и преданность.

Рисунки по клеточкам сложные

Согласитесь, чем сложнее и замысловатее рисунок, тем он красивее. Совсем не жалко потраченного времени, ведь каждая работа индивидуальна и несет личную энергетику мастера.

Крутые рисунки по клеточкам

Рисование портретов по клеточкам – настоящее искусство. Такие работы создаются очень просто, стоит лишь строго следовать подробным схемам.

Еще несколько вариантов крутых пиксельных арт–рисунков.

Рисунки по клеточкам Новый год

Зимние традиции и приход новогодних праздников также можно изобразить с помощью клеток.

Символ нового 2019 года

Всячески поощряйте стремление детей к рисованию. И пусть в будущем не все они станут известными художниками, но такое занятие способно принести им радость и развить художественный вкус.

Как нарисовать по клеткам сложные картины. Рисование по клеточкам. Как и что нарисовать поэтапно? Легко

Не каждому удалось окончить художественную школу, чтобы научиться технике рисования. Если хотите сделать креативную открытку или заполнить дневник оригинальными рисунками, освойте рисование по клеточкам. Маленькие картинки по клеточкам смогут сделать даже новички. Главное, купить тетрадку для математики со светлой бумагой.

Как рисовать по клеточкам

Многие любят разгадывать японские кроссворды, в основу которых положено рисование по клеточкам. Если у вас есть готовые разгаданные кроссворды или ответы к ним, то сможете просто перерисовать в свою тетрадку большие фигуры.

Самый хороший способ использовать готовые схемы, которые были специально разработаны для тех, кто не умеет рисовать. Вы можете закрашивать по схеме клеточки в собственной тетради, а потом удивлять красивыми изображениями близких и родных.

Среди шаблонов вы найдете

Оригинально смотрятся фрукты по клеточкам . Если хорошо закрасить рисунок яркими фломастерами, то потом можно его вырезать и использовать для декора интерьера или украшения аппликации.

Хотите сделать открытку или описать в своем дневнике романтическую историю, тогда нарисуйте сердечко по клеткам.

Конфетки, букетики, цветочки – все это можно нарисовать по клеточкам.

Если вы освоите принцип, то потом сможете изображать все, что угодно в своей собственной тетради.

Хотите придумать свой собственный рисунок? Тогда сделайте легкую зарисовку, а потом начинайте превращать ее в рисунок по клеточкам. Начинать лучше всего с контура. Потом можете выделять мелкие детали. Не забудьте отметить, каким цветом, какая деталь должна быть выделена, чтобы рисунок получится ярким и красивым.

3D-рисунки по клеточкам – это хороший способ провести интересно досуг и реализовать свои творческие способности.

Вы еще ни разу не рисовали по клеточкам? Тогда обязательно попробуйте. Это занятие придется по душе как маленьким детям, так и взрослым. Специалисты отметили, что это хобби развивает творческое мышление, координацию движений при письме, концентрацию внимания и логику. Проводите досуг с пользой, выдумывая новые 3Д схемы простые и сложные для рисования по клеточкам.

Сложный рисунок по клеточкам

Предлагаем фото нескольких популярных схем для начинающих

Детей бывает сложно удивить, но это не означает, что сделать это невозможно. И после целого дня беготни, прыганья, танцев, игр, каждый должен немного успокоиться и заняться чем-то творческим и развивающим. На помощь и приходят маленькие рисунки по клеточкам. Когда нужно занять малышей – вытяните большой лист бумаги в клеточку, чтобы дети могли рисовать вместе.

Маленькие рисунки по клеточкам, хорошая или плохая идея?

Конечно, маленькие рисунки по клеточкам в блокноте – также хорошая идея, особенно, когда вы находитесь в пути с ребенком и занять его нечем. Маленькие и милые они помогут вашему чаду хорошо провести время, они получат от таких занятий максимум пользы. Маленькие рисунки по клеточкам в тетради — простая художественная деятельность, в которой сочетаются искусство и математика.

Леденцы по клеточкам фото

Картошка фри по клеточкам

Котенок по клеткам фото

Инструменты для рисования маленьких картинок по клеткам

Не говорите детям много, сделайте сюрприз, возьмите бумагу разного типа, маркеры или цветные карандаши и ручки и позвольте детям приступить к рисованию. Рисунки могут быть произвольными, иногда полезно дать возможность ребенку развить фантазию посредствам рисования. Но можно выбирать и конкретные для 5 лет.

Если у вас есть домашний принтер – тогда вообще здорово. Вы можете настроить и создать собственную графическую бумагу в специальном приложении. У них есть много вариантов для графической бумаги — обычный квадрат, треугольник, и многое другое. Но на этот шаг решайтесь после того, как дети освоят рисование по клеткам. В приложении все же легко выбрать размер формы, которая вам нужна, толщину, цвет линий и многое другое. Тогда макет просто сохраняется их в формате pdf и вы можете распечатать его сразу же.

Используя обычную бумагу в клеточку, можно сделать простые повторяющиеся рисунки, рисунки шахматной доски. Можно объединить квадраты, чтобы делать большие фигуры и разделять квадраты на треугольники и меньшие квадраты и даже на восьмиугольники, чтобы делать всевозможные интересные изображения.

Треугольники и шестиугольники также хорошо подходят для узоров и картин. Для тех, кто уже хорошо справляется с разными фигурами и отлично ориентируется в основах геометрических форм, можно взять за шаблон смайлики из вк. Позвольте ребенку выбрать любимые смайлики и перерисовать их в тетради. Хорошей идеей являются и животные.

Рисовать их первый раз может быть не так просто, если использовать клеточки, но на самом деле, дети быстро подхватят эту идею и уже спустя какое-то время смогут воплощать на листе в клеточку самые смелые идеи.

Несмотря на то, что это простая идея, она дает много пространства для творчества, что с большим количеством случайных математических понятий дает большой бонусный плюс для развития ребенка.

Арбуз по клеткам фото

Миньоны по клеткам фото

Супергерои по клеткам

Котик аниме по клеткам

Графический диктант

Стоит отметить, что задания с графической бумагой популярны в детских садиках. Один из распространенных приемов – создание рисунка без образца. Это своеобразный графический диктант. Такое задание легко воспроизвести дома со своим ребенком. Для этого упражнения мы будем использовать листы бумаги формата 4×4. Начиная с левого верхнего угла, мы будем начинать закрашивать квадратики с помощью простых инструкций. Эти инструкции включают:

переместить один квадрат вправо;
переместить один квадрат влево;
переместить один квадрат вверх;
переместить один квадрат вниз. Вот как мы будем писать алгоритм, чтобы проинструктировать ребенка (который будет закрашивать клеточки).

Выберите простой рисунок, такой как шахматная доска, который будет использоваться в качестве примера. Это хороший способ ввести все символы в ключ. Чтобы начать, заполните график для ребенка — квадрат к квадрату — затем попросите его помочь описать, что вы только что сделали. Во-первых, вы можете говорить алгоритм вслух, тогда вы можете превратить свои словесные инструкции в программу. Пример алгоритма: «Переместить вправо, заполнить квадрат, двигаться вправо, сдвигаемся вниз. Заполнить квадрат, переместиться влево, переместиться влево, заполнить квадрат».

Если ребенок хорошо справляется с этим упражнением, то это повод придумать альтернативное задает с похожей сутью, но сложнее. Если есть еще непонимание, сохраните это задание и попробуйте повторить это на следующий день, а пока поработайте с другим примером.

Если ребенок понимает алгоритм и может определить правильные символы для каждого шага, он готов двигаться дальше. В зависимости от вашего ребенка, его возраста и развития вы можете либо попытаться сделать сложную сетку вместе, либо перейти к тому, чтобы ребенок работал в паре с другом. Им понравится играть вместе, давая друг другу такие задания. Это отличный способ заставить ребенка работать творчески, придумывая собственные веселые картинки и разбивая их на алгоритмы передвижения по клеткам и их заполнения.

Маленькие рисунки по клеточкам на фото:

Вот уж никогда не думала, что популярная студенческая забава рисовать картинки по клеточкам означает не только коротание времени на лекции!

Это, конечно, не очень хорошо – не слушать лекции, но иногда (в редких случаях и при наличии уважительной причины) допустимо.

Тогда мы совершенно не думали о том, что это не простое времяпрепровождение, а действие, имеющее еще и психологическое значение, и оно будет так популярно в наше время!

Оказывается – рисование по клеточкам у детей развивает мелкую моторику, воображение, логику мышления. Впрочем, это все можно отнести, к подросткам и взрослым представителям человечества, ну может быть за исключением моторики. Сейчас эта забава (рисование по клеточкам) даже получила красивое называние – пиксель арт.

Польза рисования по клеточкам в тетради для детей и взрослых

Кроме убивания времени и лекарства от скуки, развития мелкой моторики и воображения. рисование по клеточкам помогает в утверждении своего Я.

Каким образом происходит самоутверждение? Все просто. Есть люди, которые любят рисовать, но у них это плохо получается. Ну не дал им Бог таланта! И вот тут им на помощь приходит пиксель арт. Вы можете рисовать! Вы можете переносить на лист бумаги свое видение мира и иллюстрировать свои мысли!

А еще это отличный способ сосредоточиться и успокоиться, что в наш стремительный век стрессов и страстей весьма важно.

Рисовать по клеточкам очень просто, сделать это можно двумя способами:

на листке в клеточку (это может быть простой листочек из тетради по математики)
нанести клетки определенного размера на понравившийся рисунок и затем планомерно перенести его на другой листок

Конечно, второй способ сродни плагиату, но никто и не претендует на авторство той или иной скопированной картины, а вот моральное удовлетворение от своего творчества вы получаете огромное.

Первый способ отлично подходит не только для детей всех возрастов – от дошкольников до подростков, но и взрослым.

Кроме всех перечисленных «полезностей» рисование по клеточкам помогает развить чувство цвета. Рисунок можно сделать цветным, используя всю палитру красок.

Для пиксель арта не требуется никаких дорогостоящих принадлежностей – листок в клетку, карандаш или ручка найдется у каждого человека. Хотите добавить цвета – возьмите цветные карандаши, ручки, мелки (хоть ими не очень удобно прорисовывать мелкие детали).

Если бумага или взятый вами листок тонкий, или фломастеры пропечатываются с другой стороны – подложите плотный лист бумаги или картон для того чтобы не испортить поверхность стола за которым вы работаете или другой чистый лист бумаги.

Графический диктант

Разъясним тем, кто впервые прочитал это словосочетание – «графический диктант». Это рисование по клеточкам по заданному заранее алгоритму. Например, вы диктуете ребенку в какую сторону (вправо, влево, вверх, вниз) на сколько клеточек провести линию.

К такому диктанту надо заранее подготовиться. У вас должен быть листок с четким планом, алгоритмом диктовки и конечным результатом (какой рисунок в конечном итоге должен получиться у ребенка).

Положительные аспекты такого диктанта:

развитие внимательности
развитие логического мышления, ориентации в пространстве
подготовка руки к письму (развитие мелкой моторики)
развитие усидчивости (что важно для современных гиперактивных детей)

Начинать графические диктанты надо с простых рисунков (например, с лестницы) и постепенно переходить к более сложным рисункам.

В самом начале диктанта четко проговаривайте, с какой точки начинаем рисунок, например, 9 клеточек сверху, 9 клеточек слева и ставим точку. Именно она и является отправной.

Пример графического диктанта Ключик».

Отступите по 5 клеток сверху и слева, поставьте точку – она будет являться отправной.

1 клетка вправо, 1 клетка вверх, 1 клетка вправо, 1 клетка вниз, 1 клетка вправо, 1 клетка вниз
8 клеток вправо

по одной клетке:

вверх
вправо
вверх
вправо
вправо
вправо

12 клеток влево и по одной клетке:

влево
влево
вверх
влево

3 клеточки вверх.

Рисунок готов!

Если вы обладаете навыками рисование по клеточкам или большой фантазией, рисунок можно нарисовать самостоятельно и затем составить алгоритм. Можно поступить и по-другому – купить сборник графических диктантов. Такие сборники могут быть для детей определенного возраста, для девочек или мальчиков. Рисование по клеточкам и графические диктанты – это интересная игра, которая помогает развить нужные ребенку навыки.

Примеры рисунков для простого графического диктанта.

Посмотрите видео пример графического диктанта.

Рисунки по клеточкам в тетради легкие и сложные

Начинать рисовать по клеточкам надо с легких рисунков, постепенно переходя к более сложным вариантам. Легкие рисунки просты в выполнении и доступны маленьким детям. Ниже приведены легкие варианты рисунков, которые по плечу маленьким детям.

Освоив технику рисования по клеточкам можно приступать и к более сложным вариантам

Ну, и наконец, научившись «клеточному» рисованию начинайте осваивать цветовое оформление рисунка.

Рисунки по клеточкам в тетради для детей

Когда на свет появляется маленький человечек, у родителей добавляется хлопот и забот. Воспитание ребенка заключается не только в том, чтобы его покормить, одеть и обуть. Воспитание — это еще и развитие его способностей.

Сейчас разработано много различных способов и методик для этого, но все специалисты сходятся во мнение – развитием ребенка лучше всего заниматься в игровой форме. Методом с элементами игры обучают начальным знаниям по математике, родному языку и еще многому, тому, что необходимо для гармоничного развития ребенка.

Одним из способов развития логических способностей ребенка считается рисование по клеточкам. Начинать надо с простейших рисунков, например, таких, как елочка, пароход, флажок.

Рисунки по клеточкам помогут вам в изучении букв. Нарисовав букву по клеточкам, малыш не только воспринимает ее на слух, не только видит ее написание, но и как бы осязает ее. Включаются все виды памяти – слуховая, зрительная и механическая (рисует букву).

Кроме буквы можно прописывать палочки, лесенки и другие фигуры тем самым тренируя детскую руку и подготавливая ее к письму. Такие упражнения помогут ребенку в школе.

Чему учится ребенок, рисуя по клеткам? Правильно держать карандаш, правильному алгоритму действий, счету, творческому подходу к делу, внимательности и усидчивости.

Постепенно стоит усложнять графику рисунка и вводить цвета. Ребенок может сам выбирать цветовое решения, тем самым развивая чувство цвета и цветовых сочетаний. К слову, такое рисование помогает выявить, творческие способности детей.

Рисунки по клеточкам легкие и сложные для девочек и для мальчиков

То, что рисунки по клеточкам или арт пиксель — занятие полезное вы уже поняли. При выборе рисунков их можно подобрать по интересам, отдельно для девочек и отдельно для мальчиков. С помощью этой техники рисования вы можете, даже не обладая навыками рисования воплотить на листке все, что захотите.

Вот несколько примеров рисунков для мальчиков.

А такие рисунки на листке в клеточку сможет нарисовать любая девочка.

Рисунки для личного дневника

Что такое личный дневник? Для кого-то это способ самовыражения, для кого-то фиксация событий происходящих в его жизни, личная оценка этих событий, людей, происшествий. Кто-то записывает внезапно посетившие его идеи и мысли. Личные дневники ведут многие люди — мальчишки, девчонки, взрослые женщины и мужчины.

Некоторые события, происходящие в жизни великих людей стали известны из их личных дневников. Часто записи в личных дневниках сопровождались иллюстрациями, нарисованными авторами. К слову, такие иллюстрации великих людей часто становились раритетными и помогали раскрыть более глубоко личность этого человека.

А если к рисованию нет таланта, а выразить свои эмоции хочется не только посредством слов, но и рисунка? И как же в этом случае проиллюстрировать свои записи? В этом случае на помощь могут прийти рисунки по клеточкам. Рисовать их просто и для этого не требуется ничего кроме листка в клетку и карандаша. Можно воспользоваться уже готовыми рисунками. Перенесите их в свой личный дневник следующим способом:

сделать сетку из клеточек на выбранном рисунке
в тетрадке (дневнике) начертить такую же сетку по количеству клеток (клетки могут быть другого размера – больше или меньше)
начать перенос изображения из каждой клеточки на выбранном рисунке в такую же клетку на листке

В интернете есть множество примеров рисунков по клеточкам – вам надо только выбрать и нарисовать.

Какими рисунками «оживить» личный дневник – решать вам. Чуть ниже приведено несколько интересных рисунков по клеткам.

Пусть дети рисуют, творят, фантазируют! Не каждый из них станет художником, но рисование доставит им удовольствие, они познают радость творчества, научаться видеть прекрасное в обычном. Пусть они растут с душой художника!

Более сложные рисунки подойдут тем кто уже натренировался на и рисунках по клеточкам, и желает попробовать нарисовать что-то более сложное. В нашей галерее представлены как портреты так и и просто классные рисунки по клеточкам для срисовки в тетради.

Для более сложных рисунков лучше подойдёт миллиметровая бумага.

В Живую это выглядит примерно вот так:

А здесь вы можете заказать классный портрет с использованием технологии флип-арт.
Технология флип-арт, это рисование с использованием красок и трафарета.

Рисунки по клеточкам в тетради — отличный способ скоротать время. Для такого рисования не требуются специальные навыки. Достаточно открыть понравившийся образец рисунка на нашем сайте и следовать геометрии тетради — небольшим клеточкам. Стандартный размер клеточек в тетради — 5×5 мм. Для рисования по клеточкам подойдут самые простые школьные тетради.

Рисунки по клеточкам в тетради — отличный способ скоротать время

Благодаря рисованию вы сможете увлечь себя во время скуки. Рисование по клеточкам — это не только увлекательно, но и полезно. Те, кто не имеет художественного опыта, могут получить его благодаря этому типу рисования.

Рисунки по типам:

Рисование по клеточкам в тетради развивает творческое мышление, координацию и оказывает отличное успокаивающее действие.

Рисунки по клеточкам

Рисунки по уровню сложности

На нашем сайте представлены примеры рисунков разной сложности. У нас вы можете найти рисунки для начинающих (подойдут для детей и тех, кто хочет быстро и без лишних усилий создать красивый рисунок), а также более сложные варианты. Для начала вы можете попробовать создать самые простые рисунки, после чего переходить на более серьёзный уровень.

Неважно, какой сложности вы выбрали рисунок. Главное, что вы сможете приятно провести время и хорошо расслабиться. С такими рисунками могут справляться как взрослые, так и дети, которые никогда не занимались творчеством.

Польза для детей

Если взрослые могут просто скоротать время за этим интересным занятием, то дети извлекают из этого огромную пользу. Занимаясь рисованием по клеточкам, дети развивают воображение, математическое мышление и стратегию. Это даёт некоторый опыт, который способен помочь детям научиться рисовать более крупные и сложные рисунки.

Положительное действие такое рисование оказывает и на нервную систему. Это помогает успокоить нервы, снять психологическое напряжение и подавить гиперактивность. Рисование по клеточкам под спокойную музыку — отличный способ релаксации.

Что можно рисовать?

Рисовать по клеточкам можно что угодно: животных, растения, пейзажи, красивые надписи, смайлы, персонажей мультфильмов и т.д. На нашем сайте представлены разные варианты рисунков: как для девочек, так и для мальчиков. Вы можете выбрать любой из них и приступить к рисованию прямо сейчас.

Как рисовать?

Для рисования по клеточкам нужно запастись простой школьной тетрадкой (или более крупной, формата А4) и пишущими принадлежностями. Для закрашивания клеточек можно использовать простые ручки и карандаши, а также разноцветные фломастеры, мелки и ручки. Благодаря такому простому набору предметов можно создать по-настоящему красивые и необычные рисунки. Приступайте прямо сейчас.

Легкие рисунки по клеточкам для начинающих

Сегодня рисунки по клеточкам популярны как среди детей, так и среди взрослых. Чтобы создавать такие рисунки, людям не нужны какие-либо навыки и умения. Даже если вы впервые держите в руках фломастер, у вас без особого труда получится создать красивый рисунок. Всё, что вам нужно для такого рисования — простая школьная тетрадь, несколько фломастеров (или простая шариковая ручка) и немного свободного времени.

Польза рисования по клеточкам

Рисование по клеточкам полезно как для взрослых, так и для детей. Взрослые благодаря рисованию по клеточкам могут скоротать время за интересным занятием, а также снять эмоциональное напряжение. Такое рисование хорошо успокаивает, что очень актуально для людей, живущих в современном городском ритме. Также рисование по клеточкам будет полезно тем, кто хочет получить небольшой опыт в творческой сфере. Благодаря этому виду рисования можно освоить основы творчества, что положительно скажется на общих умениях.

Дети благодаря рисованию развивают воображение, внимание и даже математическое мышление. Рисование способно снять эмоциональное напряжение и подавить гиперактивность у непоседливых детей. Если вы хотите, чтобы ваш ребёнок получал пользу в свободное время, заставьте его рисовать. Это гораздо полезнее и познавательнее, чем сидеть целыми сутками в интернете.

Рисунки по клеточкам по уровню сложности

На нашем сайте представлены рисунки как для начинающих, так и для опытных художников. На самом деле, каким бы сложным ни был рисунок, с ним справится любой. Просто на некоторый рисунок нужно потратить меньше времени, на другой — значительно больше. Для создания некоторых рисунков достаточно одного простого карандаша, для других нужны цветные фломастеры.

Если вы впервые зашли на наш сайт, стоит выбрать . Такие рисунки максимально просты и отнимают минимум времени. Буквально за 10-15 минут у вас получится готовый рисунок, в процессе рисования которого вы получите много удовольствия.

Что можно рисовать?

Если вы выбрали легкие рисунки по клеточкам для начинающих , можете нарисовать разнообразные смайлы, красивые надписи, цветы, фигурки, животных и многое другое. На нашем сайте представлены разные варианты рисунков, поэтому вы легко найдёте подходящий для себя вариант.

Чем рисовать?

Чтобы создать рисунок по клеточкам, вам понадобится самый простой набор: простая школьная тетрадь, набор цветных карандашей/фломастеров или обычная ручка. Выбирайте любой понравившийся рисунок и приступайте к рисованию прямо сейчас.

Фотографии рисунков по клеточкам

Вашему вниманию каталог фотографий примеров и эскизов для рисования по клеточкам в тетрадках.

Фотографии котиков

Маленькие рисунки по клеточкам

Маленькие рисунки по клеточкам — отличный способ скоротать время. Рисование этого типа пользуются популярностью среди взрослых и детей. Это позволяет расслабиться и получить удовольствие от процесса.

Польза рисования по клеточкам

Такое рисование не только увлекательно, но и очень полезно. Те, кто хочет научиться красиво рисовать, могут начать именно с рисунков по клеточкам, поскольку они максимально просты и не требуют больших временных затрат. Школьники могут создать целый рисунок на перемене, а взрослые — во время свободного времени на работе, что позволит успокоиться и снять эмоциональное напряжение.

Что можно рисовать?

Чтобы нарисовать маленький рисунок по клеточкам , достаточно иметь простой набор принадлежностей: обычную школьную тетрадь и набор фломастеров (или простую ручку). Вы можете нарисовать красивую надпись, смайлы, небольших животных, различные символы и многое другое. Процесс рисования займёт всего 10-15 минут.

Из представленного списка вы можете выбрать любой понравившийся рисунок и приступить к рисованию прямо сейчас.

Рисунки по клеточкам востребованы как среди взрослых, так и среди детей

Рисунки по клеточкам востребованы как среди взрослых, так и среди детей. Когда вам нечем заняться и хочется расслабиться, стоит попробовать этот вид рисования. Рисунки по клеточкам — это отличный способ расслабиться и доставить себе удовольствие.

Для создания такого рисунка вам понадобится самый простой набор принадлежностей: школьная тетрадь, простая ручка или набор фломастеров/карандашей. На создание одного рисунка уйдёт не более 20 минут.

Виды рисунков

На простом листе в клеточку вы можете изобразить почти что угодно: животных, цветы, смайлы, персонажей мультфильмов или видеоигр, разнообразные символы и многое другое. На нашем сайте представлен отдельный список «рисунки по клеточкам для девочек». В списке имеются как сложные рисунки, так и самые простые. Заниматься таким рисованием вы можете дома или на переменах в школе. Самый простой рисунок можно создать всего за 10 минут.

Рисунки по клеточкам для девочек позволят расслабиться и улучшить творческие навыки. Такое рисование не только познавательно, но и очень полезно.

Рисунки для девочек

Фотографии рисунка по клеткам — Сердечко

Фотографии рисунков по клеткам — Пони

Сегодня рисунки по клеточкам очень популярны среди подростков

Сегодня рисунки по клеточкам очень популярны среди подростков. Большой популярностью пользуются рисунки для личного дневника . На таких рисунках может быть изображено почти что угодно: от животных до смайлов и различных символов.

Польза рисунков по клеточкам

Благодаря таким рисункам дети и подростки могут провести свободное время с пользой. Даже если у вас нет творческих навыков, вы легко сможете нарисовать рисунок по клеточкам любой сложности. Если вам необходимы рисунки для личного дневника , ознакомьтесь с нашим списком и выберите наиболее подходящие варианты для себя.

Занимаясь таким рисованием, дети развивают творческие навыки, воображение, внимание и даже математические способности. Благодаря такому рисованию можно отлично расслабиться и снять эмоциональное напряжение.

Что нужно для рисования?

Если вы ведёте красочный и яркий дневник, вам понадобится набор цветных фломастеров или карандашей. Если же красочность дневника вам не важна, можно использовать простую ручку или карандаш. Нарисовать 1 рисунок можно всего за 10-15 минут.

Рисунки для мальчиков по клеточкам пользуются большой популярностью

Рисунки для мальчиков по клеточкам пользуются большой популярностью. В первую очередь они актуальны для тех, кто хочет научиться красиво рисовать. Подобные рисунки создаются всего за 15-30 минут, а также значительно улучшают творческие навыки, благодаря чему дети могут быстро научиться рисовать.

Рисунки для мальчиков

Этот раздел включает в себя рисунки разных видов: животные, машины, персонажи из различных вселенных (например, Майнкрафт или Марвел), необычные смайлы и различные символы. Примечательно, что рисунки для мальчиков чаще всего создаются одним цветом, поэтому для рисования вы можете использовать простой карандаш или ручку. Если же для вас важна красочность, можете пользоваться разноцветными карандашами или фломастерами.

Рисунки Ниндзя черепашки по клеточкам

Польза рисунков по клеточкам

Такой тип рисования способен улучшить навыки и умения в области рисования, а также развить воображение и внимание. Кроме того, благодаря рисованию можно отлично расслабиться. Потратив всего 15 минут, вы сможете создать красивый и привлекательный рисунок.

Рисунки по клеточкам — отличное решение для тех, кто хочет научиться красиво рисовать

Рисунки по клеточкам — отличное решение для тех, кто хочет научиться красиво рисовать. Такие рисунки не требуют специальных навыков и умений. Всё, что вам нужно — школьная тетрадь и набор фломастеров. Создать рисунок по клеточкам можно и с помощью простого карандаша. На создание рисунка по клеточкам средней сложности уходит 30-40 минут.

Как рисовать?

Единых правил по такому рисованию нет. Но гораздо удобнее рисовать сверху вниз, заполняя рисунок слева направо. Для общего развития можно попробовать рисовать от центра к краям изображения.

Для рисования можно использовать как простые карандаши или ручки, так и разноцветные наборы. Изобразить можно что угодно: животных, цветы, персонажей известных мультфильмов или игр, смайлы, красивые надписи и т.д.

Фото рисунков по клеточкам

На нашем сайте представлены качественные фотографии рисунков разной направленности. Благодаря им вы сможете быстро создать красивый рисунок. Процесс рисования доставит удовольствие и поможет хорошо расслабиться. Приступить вы можете прямо сейчас.

Ам ням по клеткам

Кактус по клеточкам

Мороженое -рисуем по клеточкам

Слово любовь по клеткам

Рисунок собачки по клеточкам

Рисуем хомяка по клеточкам

Если Вам понравились рисунки, пишите в комментариях!

Рисунки по клеточкам в тетради: легкие для начинающих, сложные и красивые

Всем привет. Сегодня у меня творческая тема, в которой я вам расскажу и поэтапно покажу, что такое рисунки по клеточкам в тетради, они будут легкие и сложные, на разные темы и для разного возраста.

Графические рисунки по клеточкам, это увлекательное занятие, с которым я познакомилась во время беременности. Отличное успокоительное средство, не имеющее побочных эффектов и противопоказаний. Спустя время, я вспомнила это интересное творческое занятие, решила с вами поделиться простыми и сложными шаблонами для девочек и мальчиков.

Эти графити в тетрадях подойдут для самых юных школьников, начиная с 7 лет. В основном интерес у детей просыпается в 9-13 лет, первыми начинают девочки, мальчики глядя на них повторяют.

Легкие рисунки по клеточкам в тетради

На примере таблицы покажу схему смайлика с вк с подробным описанием работы. В каждой строке указана цифра с буквой, цифра, это число клеток, а буква, это цвет клеточек. К примеру, б обозначает белый цвет, ж – желтый, к – красный, ч – черный.

Строка	Цифра – число клеточек/ буква — цвет
1	11 б, 8 ж
2	9 б, 12 ж
3	7 б, 16 ж
4	6 б, 18 ж
5	5 б, 20 ж
6	4 б, 22 ж
7	3 б, 24 ж
8	2 б, 4 ж, 2 к, 3 ж, 2 к, 4 ж, 2 к, 3 ж, 2 к, 4 ж
9	2 б, 3 ж, 4 к, 2 ж, 4 к, 1 ж, 4 к, 3 ж
10	1 б, 4 ж, 9 к, 2 ж, 9 к, 4 ж
11	1 б, 4 ж, 9 к, 2 ж,9 к, 4 ж
12	1 б, 5 ж, 7 к, 4 ж, 7 к, 5 ж
13	1 б, 6 ж, 5 к, 6 ж, 5 к, 6 ж
14	1 б, 7 ж, 3 к, 8 ж, 3 к, 7 ж
15	1 б, 28 ж
16	1 б, 28 ж
17	1, б, 28 ж
18	2 б , 26 ж
19	2 б, 6 ж, 14 ч, 6 ж
20	3 б, 5 ж, 14 ч, 5 ж
21	3 б, 6 ж, 12 ч, 6 ж
22	4 б, 6 ж, 10 ч, 6 ж
23	5 б, 6 ж, 8 ч, 6 ж
24	6 б, 18 ж
25	7 б, 16 ж
26	8 б, 14 ж
27	11 б, 8 ж

По такому принципу можно нарисовать простой рисунок по клеточкам ребенку, либо сложный взрослому. Самые популярные, это смайлы из вк, новогодние, летние, звери и еда. Транспорт почему — то не пользуется популярностью. Зато машинки, самолеты, и прочее часто используют в графическом диктанте по клеточкам.

Рекомендую: Графические рисунки по клеточкам

Предлагаю ознакомиться со смайликами, которые улыбаются, подмигивают, хохочут, с косичками и в очках.

А это самый радостный смайл с большой улыбкой.

Рисунки по клеточкам в тетради для девочек

Среди юных красавиц огромной популярностью пользуются надписи в тетрадях, а именно имена девочек. Но только представьте, если я вам буду показывать схему каждого имени девочки или мальчика, только на букву А, надо написать как минимум 40 имен.

Времени терять я не стану, покажу красивые схемы для начинающих, возможно, они вам и понравятся.

Начну я свою подборку с милого котенка, а точнее с Хелоу Кити, эта милая мордашка является символом моего сайта для всей семьи.

Этот шаблон немного сложнее, сгодится для 10 лет.

Все девочки любят пони, почему бы не нарисовать это маленькое животное в тетради, опираясь на готовый шаблон.

А вот еще один милый котенок в шляпке.

Посмотрите, какие котики могут красоваться в тетрадях в клеточку.

Рисунки по клеточкам в тетради для мальчиков

Мальчики больше любят рисовать рисунки майнкрафт, но я решила показать вам немного других интересных схем.

Все дети играли или играют в спинер, это такая штука с подшипниками, которая крутится. Ловите мальчики шаблоны этого агрегата.

Для мальчиков 10 лет подойдут андроид по клеточкам, и даже Босс — молокосос.

Свои творения вы можете делать цветными, при отсутствии палитры, выполните рисунок по клеточкам обычным простым карандашом, тогда они у вас получатся черно — белые.

Рисунки по клеточкам в тетради – сложные

Сложно подобрать самые сложные рисунки, ведь в этом случае надо учитывать возраст художника. Животные по клеточкам относятся к нелегким работам, все объемные тоже попадают под эту категорию.

Для вас я подобрала красивые рисунки по клеточкам в тетради, но при этом сложные и мультяшные.

Такие замечательные Миньоны могут попасть в вашу коллекцию.

Рисунки по клеточкам в тетради – еда

Ну как обойтись без еды, особенно без фруктов, ведь в них много полезных веществ. Витамины мы кушаем, а вот рисование таких продуктов улучшает мозговую деятельность, развивает память, мышление и моторику пальцев.

Конфета чупа — чупс.

Красивые и сложные клубнички.

Яблочки.

Эскимо на палочке.

Дольки арбузов.

Клубнички.

Киви в разрезе.

Сочная груша.

Вишенки.

Ананас.

Какой выбрать шаблон девочке, мальчику или взрослым, решать вам, все они очень красивые, милые и новые.

Рисунки по клеточкам в тетради – животные

Животные бывают маленькие, милые, красивые и большие, именно это все я собрала в одной категории. Сложные рисунки с животными подходят для взрослых, либо детей от 12 лет.

Пингвин.

Панда.

Обезьянка.

Мышонок.

Лисичка.

Кот на луне.

Зайчик.

Гусь.

Бабочка.

Свинья.

Сова.

Божья коровка.

Все шаблоны для срисовывания можно бесплатно скачать.

Рисунки по клеточкам на Новый год

Если вы ходите выполнить работу в большом формате, тогда вам две клеточки надо брать за одну либо наоборот. Предлагаю ознакомить с фото и схемами красивых сложных и простых новогодних рисунков для тетрадей.

Снежинки.

Рисунки по клеточкам – лето

К лету можно изобразить графический рисунок, как мальчикам, так и девочкам. Для детей 7 – 9 лет выберите легкий и красивый шаблон, к примеру, пальма или мороженое эскимо.

Утка.

Для детей 10 – 12 лет сгодятся более сложные рисунки по клеткам, к примеру, дельфин, солнцезащитные очки.

Рисунки по клеточкам в тетради – цветы

Шаблоны цветов по клеточкам чаще всего используют девочки или женщины рукодельницы, ведь такие схемы подходят для вышивания и вязания. Вот несколько графических роз.

Друзья, если вы любите рисовать, у вас есть свободное время, попробуйте повторить мои рисунки по клеточкам в тетради, для вас я подробно разобрала один смайлик, показала схемы и шаблоны, поделила все изображения на категории. Если вам трудно справиться со сложными заданиями, начните с рисунка для начинающих, советую даже не смотреть на категорию для девочек или мальчиков, важно, чтобы вам это понравилось.

Подбирала для вас рисунки по клеточкам в тетради Нина Кузьменко.

Сложные паттерны, образованные подвижными клетками Escherichia coli

Adler, J. Science 153 , 708–716 (1966).

ADS CAS Статья Google Scholar

Nossal, R. Expl Cell. Res. 75 , 138–142 (1972).

CAS Статья Google Scholar

Вулф, А. Дж. И Берг, Х. К. Proc. натн. Акад. Sci. США 86 , 6973–6977 (1989).

ADS CAS Статья Google Scholar

Adler, J. Science 166 , 1588–1597 (1969).

ADS CAS Статья Google Scholar

Dahlquist, F. W., Lovely, P. & Koshland, D. E. Jr Nature new Biol. 236 , 120–123.(1972).

CAS Статья Google Scholar

Berg, H.C. Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 55 , 539–545 (1990).

CAS Статья Google Scholar

Macnab, R. M. in Escherichia coli и Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology Vol. 1 (ред. Нейдхардт, Ф. С. и др. ) 732–759 (Американское общество микробиологии, Вашингтон, округ Колумбия, 1987 г.).

Google Scholar

Qu, Y. & Adler, J. Proc. натн. Акад. Sci. США 86 , 8358–8362 (1989).

ADS Статья Google Scholar

Месибов Р. и Адлер Дж. J. Bact. 112 , 315–326 (1972).

CAS PubMed Google Scholar

Нейдхардт, Ф.C., Ingraham, J. L. & Schaechter, M. Физиология бактериальной клетки Ch. 7 (Sinauer Associates, Сандерленд, Массачусетс, 1990).

Google Scholar

Берг, Х. К. и Тернер, Л. Nature 278 , 349–351 (1979).

ADS CAS Статья Google Scholar

Холливелл, Б. и Гаттеридж, Дж. М. С. Свободные радикалы в биологии и медицине (Oxford University Press, Oxford, 1985).

Google Scholar

Сторц, Г., Тарталья, Л. А., Фарр, С. Б. и Эймс, Б. Н. Trends Genet. 6 , 363–368 (1990).

CAS Статья Google Scholar

Берг, Х. К. и Тернер, Л. Biophys. J. 58 , 919–930 (1990).

ADS CAS Статья Google Scholar

Берг, Х.C. & Purcell, E. M. Biophys. J. 20 , 193–219 (1977).

ADS CAS Статья Google Scholar

Лосик Р. и Шапиро Л. Microbial Development (Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк, 1984).

Google Scholar

Shimkets, L. J. & Kaiser, D. J. Bact. 152 , 451–461 (1982).

CAS PubMed Google Scholar

Герхарт Дж. Trends Genet. 5 , 233–236 (1989).

CAS Статья Google Scholar

Остер, Г. Ф. и Мюррей, Дж. Д. J. exp. Zool. 251 , 186–202 (1989).

CAS Статья Google Scholar

Миллер, Дж.H. Experiments in Molecular Genetics 431 (Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк, 1972).

Google Scholar

Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J. & Berg, H. C. J. Bact. 169 , 1878–1885 (1987).

CAS Статья Google Scholar

Parkinson, J. S. J. Bact. 135 , 45–53 (1978).

CAS PubMed Google Scholar

Простые модели роста могут создавать сложные траектории онтогенеза конститутивной химической защиты морских водорослей

Abstract

Вся теория и большая часть данных по экологии и эволюции химической защиты происходят от наземных растений, которые обладают значительной способностью к внутреннему перемещению ресурсов. Напротив, большинство макроводорослей — водорослей — не обладают способностью к перемещению ресурсов или имеют очень ограниченную способность, а это означает, что компромисс между ростом и защитой, например, должен быть локализованным, а не системным.Это может изменить прогнозы теорий химической защиты морских водорослей. Мы разработали модель, которая имитировала простой образец роста красных морских водорослей Asparagopsis armata , который состоит из повторяющихся кластеров соматических клеток и клеток, содержащих сдерживающие вторичные химические вещества (клетки железы). Для этого мы создали четкую кривую роста для соматических клеток и другую для клеток желез, используя эмпирические данные. Функция соматического роста была связана с функцией роста для защиты с помощью моделирования дифференциальных уравнений, которое эффективно создавало компромисс между ростом и защитой по мере развития этих соседних клеток.Рассматривая рост и защиту как отдельные функции, мы также смогли смоделировать компромисс в росте на 2–3% в большинстве случаев. Однако мы нашли противоположные доказательства этого компромисса в эмпирических отношениях между ростом и защитой, в зависимости от уровня освещения, при котором выращивалась водоросль. После разработки модели, которая включала скорость ветвления и деления клеток, мы формально продемонстрировали, что положительная корреляция между ростом и защитой предсказывается во многих обстоятельствах, а также что затраты на выделение, если они существуют, будут ограничены внутренними моделями роста морских водорослей.Таким образом, закономерности роста могут объяснить противоречивые доказательства стоимости конститутивной химической защиты во многих исследованиях, подчеркивая необходимость учитывать фундаментальную биологию и онтогенез организмов при оценке теорий распределения для защиты.

Образец цитирования: Пол Н.А., Свенссон С.Дж., де Нис Р., Стейнберг П.Д. (2014) Простые модели роста могут создавать сложные траектории онтогенеза конститутивной химической защиты морских водорослей. PLoS ONE 9 (1): e86893.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0086893

Редактор: Маура (Джи) Джеральдин Чапман, Сиднейский университет, Австралия

Поступила: 4 июля 2013 г .; Одобрена: 17 декабря 2013 г .; Опубликовано: 30 января 2014 г.

Авторские права: © 2014 Paul et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Это исследование совместно финансировалось Австралийским исследовательским советом (P.D.S) и шведским исследовательским советом FORMAS, проект № 2007-449. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Краеугольным камнем для объяснения различий в химической защите растений является то, что существует стоимость защиты, такая, что рост, воспроизводство или другие свойства растений ограничиваются в результате отвлечения ресурсов на синтез вторичных метаболитов и структур для их хранение и транспортировка [1] — [4].На первый взгляд такие затраты на химическую защиту подразумевают, что уровни защиты и количественные вариации в других характеристиках растений, таких как рост, должны иметь отрицательную корреляцию. Однако теперь из эмпирических исследований затрат ясно, что это не всегда так [5]. Отсутствие корреляционных доказательств стоимости может указывать на то, что концентрации роста и защиты не тесно связаны [3], [6], [7]. Отсутствие коррелятивных доказательств также может быть связано с тем фактом, что рост часто измеряется только для одной онтогенетической стадии, а не для всей траектории развития [8], [9].Это потенциально проблематично, поскольку внутренние модели роста конкретной стадии могут налагать свои собственные ограничения, независимо от каких-либо компромиссов с защитой [10]. Следовательно, онтогенез теперь рассматривается как существенное препятствие для понимания компромиссов между химической защитой и другими чертами наземных растений [5], [8].

Компромиссы в морских водорослях (морские макроводоросли) могут быть менее ограничены онтогенезом, чем у наземных растений, поскольку многие водоросли являются недолговечными эфемерами с высокими темпами роста и часто не имеют системной системы кровообращения.Следовательно, отношения источник-поглотитель более локализованы, чем сосудистые растения [11]. Морские водоросли, как правило, имеют сильно различающиеся концентрации вторичных метаболитов как внутри, так и среди индивидуумов как для конститутивной, так и для индуцибельной защиты [12] — [18]. В ряде случаев эта вариация была связана с вариацией в ресурсах, таких как свет или питательные вещества [19] — [21], как предсказывают теории распределения ресурсов. Объединяющая модель распределения ресурсов привлекательна и должна применяться как к конститутивной, так и к индуцибельной защите, к растениям с принципиально разными аллелохимическими соединениями и морфологией, а также к наземным и морским системам [22], [23].Однако, как и в случае с высшими растениями, данные о стоимости химической защиты морских водорослей могут быть коррелятивными и двусмысленными [24] или даже противоречивыми [12]. Эти результаты сложно согласовать, и они предполагают, что затраты на распределение — если они есть — часто могут быть маргинальными, независимо от того, являются ли химические защиты конститутивными или индуцируемыми.

Модель, формализовавшая потенциальные компромиссы между ростом и защитой морских водорослей, потенциально может помочь в интерпретации смешанных результатов эмпирических исследований.Мы считаем, что разработка этой модели особенно важна, поскольку существует множество подходов к исследованию компромиссов между ростом и защитой, от энергетических расчетов метаболических затрат на производство и хранение метаболитов [25], [26] до затрат на приспособленность или связанных с ними экологических затрат. с упущенной возможностью [3], [4], [7], и у каждого есть свои ограничения. Сочетание дополнительных подходов возможно и полезно для зрелой области, такой как защита наземных растений, где метаболические пути хорошо установлены, и во многих случаях генетически модифицированные растения используются для проверки и построения гипотез как для индуцибельной, так и для конститутивной защиты [ 6].Однако остаются значительные пробелы в знаниях по изучению морских водорослей в каждой из этих областей, и эти пробелы усугубляются разнообразием таксонов (коричневые, красные и зеленые водоросли) и типов защиты (конститутивной, индуцибельной и активируемой [17], [22]). , [23]), которые подпадают под широкий лозунг «химической защиты морских водорослей». В качестве первого шага любая модель морских водорослей должна попытаться учесть внутренние различия между наземными растениями и водорослями, такие как ограниченное перемещение ресурсов во многих водорослях (хотя см. [11], [27]).Во-вторых, модель может быть первоначально использована для изучения конститутивной химической защиты морских водорослей, так как ее труднее изучить эмпирически, поскольку конститутивными нельзя быстро манипулировать. Преимущество моделирования распределения конститутивной защиты у морских водорослей состоит в том, что оно также позволяет нам начать с реалистичных примеров организмов с очень простыми моделями роста, таких как нитчатые водоросли, в качестве основы для морских водорослей с более сложным строением тела и большей способностью перемещать ресурсы. . Нитчатые водоросли очень разнообразны, они быстро растут и имеют относительно короткий жизненный цикл, обычно маленькие взрослые особи, и их также можно защитить химически [14], [28], [29].Более того, у некоторых видов химическая защита изолирована внутри специализированных «железистых» клеток [30]. Это означает, что простые модели роста нитчатых водорослей могут быть связаны с производством и накоплением конститутивных вторичных метаболитов в определенных клетках.

Мы исследовали взаимосвязь между ростом и конститутивной защитой у нитчатой красной водоросли Asparagopsis armata , используя как эмпирические методы, так и методы моделирования. Сначала мы манипулировали скоростью роста и индивидуальной концентрацией химической защиты, изменяя доступность света в культуре.Наша цель состояла в том, чтобы определить, приводит ли различная доступность света к эмпирическим корреляциям разной силы или знака [3], [31]. Затем мы охарактеризовали модели роста A. armata и использовали эти клеточные данные в качестве основы для набора дифференциальных уравнений, которые моделировали взаимосвязь между ростом и основной защитой. Доступность света также была имитирована в модели посредством изменений скорости ветвления и деления клеток, что позволило нам создать моделируемых индивидуумов с разными онтогенетическими траекториями клеточного развития и, следовательно, с другой историей инвестиций в соматические клетки или клетки железы.Это позволило нам напрямую сравнить эмпирические корреляции между ростом и защитой отдельных людей с прогнозами модели с использованием параметров, полученных из клеточных данных.

Материалы и методы

Исследуемый организм

Красная водоросль Asparagopsis armata Harvey (Bonnemaisoniaceae) имеет жизненный цикл с чередованием поколений между листовыми, раздельнополыми гаметофитами и нитчатым спорофитом (тетраспорофитом). Химия природных продуктов хорошо описана [28], [32], и как тетраспорофит, так и гаметофит содержат высокие и эффективные уровни галогенированных вторичных метаболитов [28], [33].В этом исследовании мы сосредоточимся на нитчатых тетраспорофитах. Эта водоросль производит простые бромированные углеводороды, такие как бромоформ и дибромуксусная кислота [32], которые активны против множества травоядных [29], [33] и подавляют морские бактерии [28]. Лица, использованные в этом исследовании, были собраны на двух неглубоких сублиторальных участках, на острове Баэр (33 ° 59 ′ 38 ″ ю.ш., 151 ° 14 ′ 00 ″ в.д.) и Лонг-Бэй (33 ° 59 ′ 10 ″ ю.ш., 151 ° 14 ′ 15 ″. E), Сидней, Австралия (с разрешения компании New South Wales Fisheries) и поддерживали в культуре при постоянной температуре (19 ° C) и освещении (при ∼40 мкмоль фотонов м ⁻² с ⁻¹) при температуре 16 ° C. 8 свет: темный цикл. A. armata легко размножается из иссеченных нитей, и его клеточные компоненты и характер роста можно легко увидеть in vivo с помощью световой микроскопии [30], [34].

Нити имеют апикальный рост и регулярно ветвятся. Нитевидная ось представляет собой повторяющееся линейное расположение кластеров клеток, каждый из которых состоит из аксиальной клетки и трех окружающих перицентральных клеток с ассоциированными клетками железы (рис. 1 вставка). Мы используем термин «клеточный уровень» для обозначения этих повторяющихся кластеров клеток (1 аксиальная, 3 перицентральных и 3 железистых клетки, что дает в общей сложности 7 клеток на каждом уровне).Клетка железы представляет собой плотную структуру, которая занимает пространство внутри перицентральной клетки (вставка на рис. 1: 2 перицентральные клетки и связанные с ними клетки железы; и см. [30]). Ранее мы продемонстрировали, что производство химической защиты напрямую связано с наличием большого рефрактильного включения в клетке железы, так как при выращивании A. armata в отсутствие брома галогенированные метаболиты больше не обнаруживаются и включение отсутствует [28], [30]. Как маленькие, так и большие клетки железы имеют одинаковую консистенцию и распределение рефрактильного содержимого на основании наблюдений с помощью просвечивающей электронной микроскопии [30].

Рис. 1. Образ жизни нитчатого тетраспорофита Asparagopsis armata .

Вне событий ветвления деление клеток происходит только в одной апикальной клетке на каждой оси. Клетки железы сначала наблюдаются примерно в 3–5 клетках от апикальной клетки. Врезка: повторяющаяся единица клеточного роста представляет собой ярус, состоящий из 7 клеток. Каждый ярус клеток (цилиндр длиной «b» и диаметром «c») состоит из 3 перицентральных ячеек, окружающих одну осевую ячейку, и каждая перицентральная ячейка содержит одну ячейку преломляющей железы (сферу диаметром «а»).Масштабная линейка 200 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0086893.g001

Эмпирические корреляции роста и защиты

Мы использовали доступность света для управления скоростью роста A. armata и коррелировали полученные вариации роста с вариациями концентраций метаболитов у целых особей. Две световые обработки обеспечивали фотосинтетически активное излучение при 10 мкмоль фотонов m ^-2 с ^-1 и 35 мкмоль фотонов m ^-2 с ^-1.Мы называем эти обработки низким и умеренным светом, так как как рост, так и концентрация бромоформа неуклонно увеличивались в предварительном анализе с увеличением света от 4 мкмоль фотонов м ^-2 с ^-1 до 60 мкмоль фотонов м ^-2 с ⁻¹. Свет в морской воде обычно считается ограничивающим для приливных водорослей ниже 100 мкмоль фотонов м ^-2 с ^-1 [35], и это было эмпирически продемонстрировано для A. armata при 19 ° C, для которых фотосинтетическая способность увеличивается линейно с доступностью света до 100 мкмоль фотонов м ⁻² с ⁻¹ [36].Обработка светом, использованная в нашем исследовании, будет актуальна для затененных мест обитания, например, под пологом более крупных водорослей, где часто можно найти тетраспорофиты A. armata .

Всего было собрано 15 особей и три небольших (10–15 клеток) апикальных среза были вырезаны у каждого человека для каждой световой обработки. Отдельные линии (семейства) поддерживали, и средние значения клонов использовали для корреляции между ростом и защитой. Водоросли культивировали в стерильном обогащающем растворе Provasoli с морской водой ½ крепости в течение 4 недель [37].Питательную среду меняли еженедельно. Из-за их небольшого размера (<0,1 мг сырой массы) рост количественно оценивался как изменение площади с использованием цифровых изображений образцов простаты (под покровным стеклом), полученных с помощью стереомикроскопа. Рост измеряли через 4 недели и уровни основных галогенированных метаболитов в каждой повторности анализировали с помощью газовой хроматографии - масс-спектрометрии [28]. Четыре основных метаболита - это бромоформ, дибромуксусная кислота (DBA), бромхлоруксусная кислота (BCA), дибромхлорметан, которые вместе накапливаются до высоких концентраций (в среднем 25 мкг мг ^-1 или 2.5% DW [28]). Метаболиты выражаются в виде массы на единицу площади (мкг мм ⁻²).

Корреляции были рассчитаны между скоростью роста и концентрацией метаболитов с использованием средних значений ( N = 2-3) для каждого семейства ( N = 15) для каждого уровня освещенности (согласно [12], [31]). Такие корреляции на уровне семьи отражают лежащие в основе генотипические корреляции [38], и градиент этой корреляции считается показателем величины эффекта для компромисса между ростом и защитой [3].Мы использовали удельную скорость роста (SGR,% d ^-1), которая представляет собой ln-преобразование конечного размера по сравнению с исходным, деленное на количество дней в культуре [ln (конечный размер / начальный размер) / 28 * 100]. Мы также оценили корреляцию между конечным размером и концентрацией метаболитов, чтобы провести сравнение с результатами моделирования, основанного на размере индивидуумов (см. Ниже). Коэффициенты корреляции для каждого уровня освещенности были повторно выбраны, и мы сообщаем значения P и r из результатов повторной выборки (рис.2a и b: 1000 симуляций, симулятор передискретизации Statistics101). Потенциальное смещение от использования размера одновременно по оси x и в знаменателе отношения по оси y (рис. 2b: см. [39]) оценивалось путем создания скорректированного градиента для каждой корреляции с использованием случайно сгенерированных данных, усеченных до диапазона значений x и y для каждого уровня освещенности. Корреляция при слабом освещении для скорректированных данных осталась отрицательной ( r = -0.200: см. Результаты).

Рис. 2. Эмпирические корреляции между общей концентрацией метаболитов и скоростью роста (A) и индивидуальным размером (B) для 15 семейств клонов как при слабом освещении (закрашенные кружки), так и при умеренном освещении (без заливки).

Сплошные линии показывают значительную отрицательную корреляцию ( P <0,05), пунктирные линии показывают положительные тенденции ( P = 0,13 A, P = 0,07 B).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0086893.g002

Сотовые модели распределения ресурсов

Одно из наших фундаментальных предположений относительно стоимости конститутивной химической защиты у этих водорослей состоит в том, что любые компромиссы между защитой и ростом будут происходить только на локальном уровне клеточного уровня.Таким образом, мера распределения в химической защите в клеточном масштабе была необходима для разработки модели роста для компромиссов в распределении ресурсов у A. armata . Было невозможно измерить концентрацию метаболитов в отдельных клетках или кластерах клеток в мелких филаментах с помощью аналитических методов, использованных выше для более крупных талломов. Поэтому мы использовали внутрииндивидуальные сравнения размеров клеток как отдельную меру распределения химической защиты. Критическое предположение модели состоит в том, что размер клеток железы по отношению к клеточному уровню представляет собой суррогатную меру распределения для химической защиты.Это предположение основано на ранее продемонстрированной взаимосвязи между концентрацией галогенированных метаболитов (наличие и отсутствие) и размером (наличие и отсутствие) большого пузырька в клетках железы Asparagopsis ([28], [30], см. также сопутствующая информация в «Исследуемом организме»). Важно отметить, что эта мера защиты также охватывала все связанные метаболиты (включая прекурсоры и второстепенные соединения) и структуры (клетки железы), которые их содержат, которые, как утверждается, сами по себе являются такими же или более дорогостоящими, чем метаболиты (например,г. [40]). Таким образом, используя этот клеточный прокси для химической защиты, мы смогли количественно оценить изменения в распределении защиты вдоль оси нитчатого роста, насколько нам известно в первый раз, когда он был исследован в таком масштабе, принимая во внимание как стадию развития клеток, так и внутреннюю паттерны роста, такие как частота ветвлений и скорость деления клеток.

Для расчета объемов клеточного уровня и клеток железы потребовались три меры (рис. 1, вставка): длина клеточного слоя и ширина филамента в центре клеточного слоя использовались для расчета объема клеточного слоя (или общего) объема ( круговая призма, включая клетки железы), а диаметр клетки железы в перицентральной клетке на самой высокой фокальной плоскости использовался для оценки объединенного объема клеток железы (т.е.е. объем 3 сферических клеток железы) для каждого яруса клеток.

Клеточные измерения были выполнены на подвыборке лиц, использованных для эмпирических корреляций (см. Выше). Сравнение водорослей ( N = 7 семейств), культивированных при 10 и 35 мкмоль фотонов м ^-2 с ^-1, проводили двумя способами. Во-первых, относительный объем клеток железы к объему яруса клеток сравнивали между апикальной и зрелой областями роста ( N = 10 ярусов клеток на область) первичной оси роста каждого индивидуума.Измерения проводились для апикальных клеток (молодые клетки, 0–300 мкм от кончика) и зрелых клеток (более старые клетки, 700–1000 мкм от кончика). Средние значения для каждой области сравнивали с помощью смешанной модели ANOVA, при этом свет (10 и 35 мкЕ) и область (апикальная и зрелая) в качестве фиксированных факторов и семейство (клоны от N = 7 особей) в качестве заблокированного фактора в нереплицированном полная блочная конструкция. Во-вторых, относительный размер клетки железы к объемам яруса клеток (в процентах) для каждого яруса клеток измеряли от вершины до 1000 мкм вдоль оси.Эти данные определили параметры клеточного роста для модели (см. Следующий раздел).

Моделирование роста и стоимости защиты в

A. armata

В этом исследовании мы используем методы моделирования дифференциальных уравнений для моделирования роста и развития A. armata (см. [41] для аналогичного подхода). Модель имитирует клеточный рост A. armata (см. Рис. 1) и работает на дискретных стадиях, определяемых делением клеток. Индивидуумы начинаются как один уровень ячеек, и при каждом делении ячеек новый уровень ячеек добавляется к предыдущему, постепенно образуя линейный массив ячеек.Люди могут ветвиться с любой желаемой частотой, которая определяется средним количеством ячеек между ветвями ( b ). Таким образом, модель определяется не временем или скоростью деления клеток, а размером человека.

Модель количественно оценивает непрерывный рост клеточного уровня (включая соматический рост) и связанных с ним железистых клеток по отдельности, рассматривая их как две отдельные функции (уравнения 1 и 2 ниже). По мере роста индивидуума рассчитывается относительный размер клеток железы к уровню клеток, который представляет собой общее относительное распределение для химической защиты.Рост клеточного уровня и рост клеток железы зависят от размера (т.е. существует максимальный размер клетки, определенный эмпирическими данными: таблица 1) и описываются сигмовидной функцией. Общее выражение для изменения размера клеток железы ( G ) при каждом делении клеток ( t ): (1) где r _g — собственный рост клеток железы, K _g — максимальный размер трех железистых клеток в совокупности, а α _g и β _g соответственно определяют гладкость функции размера и начало зависимости от размера (см. Таблицу 1 для дополнительных параметров модели, полученных из клеточного данные для слабых и умеренно легких особей).

Стоимость химической защиты в модели ограничивает рост уровня клеток, поскольку рост уровня клеток частично зависит от относительного размера связанных клеток железы. Важно отметить, что стоимость выражается только в изолированном уровне ячеек. Это дает следующее выражение для скорости изменения размера ячеек ( C ): стоимость защиты. α _c и β _c определяют гладкость размерной функции и начало размерной зависимости.

Модели роста и разработка моделей

Модель до этого момента воспроизводит параметры клеточного роста одной нити. В качестве последнего шага мы параметризовали модель частотой ветвлений и скоростью деления клеток, так как и то, и другое напрямую влияет на характер роста водорослей. Частота ветвей в апикальной области (# клеток между ветвями) и положение первого яруса клеток, содержащего железистую клетку, были определены из более раннего эксперимента, в котором особи выращивались при двух уровнях освещенности (10 мкЕ и 35 мкЕ).Впоследствии мы измерили скорость деления клеток при обоих уровнях освещения, чтобы получить данные, которые моделируют траектории роста во времени. Это было сделано с шестью новыми особями с одного полевого участка (Бэр-Айленд). Четыре апикальных части были вырезаны и акклиматизированы при 10 мкЕ и 35 мкЕ в течение 4 дней. Количество новых клеток в филаменте определяли количественно в следующие 3 дня. Скорости деления клеток ( N, = 6 семейств на уровень освещенности) сравнивали с помощью смешанной модели ANOVA со светом в качестве фиксированного фактора и семейством в качестве заблокированного фактора.

Наконец, модель была использована для суммирования уровней ячеек в масштабе целых особей. Прогнозируя развитие путем деления клеток, включая паттерны ветвления, мы смогли отслеживать объединенные (целые индивидуальные) изменения химической защиты относительно увеличения размера. Сначала мы использовали средние значения для ветвления и деления клеток, а затем впоследствии манипулировали моделями роста, используя ряд эмпирических значений, включая взаимодействие скорости ветвления и деления клеток при слабом и умеренном освещении.Для этого коэффициент вариации 0,25 и 0,05 был установлен, чтобы представить низкую и высокую дисперсию скорости деления клеток между людьми при слабом и умеренном освещении, соответственно (Таблица 1). Моделирование также включало случайные вариации скорости ветвления на основе эмпирических данных (см. Результаты: «Масштабирование модели для всего человека»). Затем для каждого из двух уровней вариации скорости деления клеток мы случайным образом отобрали 40 человек, моделируемых при слабом или умеренном освещении, и коррелировали рост и защиту для каждого уровня освещения независимо.Это обеспечило прямое сравнение смоделированных результатов с эмпирическими корреляциями роста и защиты.

Результаты

Эмпирические корреляции роста и химической защиты

Значительные корреляции между вариациями скорости роста и общей концентрацией метаболитов в 15 семьях наблюдались как для низких, так и для умеренных уровней света, но различались по знаку (рис. 2A). При слабом освещении общая концентрация метаболитов отрицательно зависела от скорости роста ( P = 0.006, r = -0,659). Снижение скорости роста с увеличением концентрации метаболитов обычно рассматривается как показатель затрат на выделение вторичных метаболитов. Однако при умеренном, но все еще ограничивающем свете (35 мкЕ) картина изменилась, и появилась тенденция к положительной корреляции между скоростью роста и продукцией метаболитов (рис. 2A: P = 0,129, r = 0,405). Средняя скорость роста особей для 10 мкЕ составила 9,1% d ^-1 (± 0.47 SE), а для 35 µE — 15,6% d ^-1 (± 0,33 SE). Корреляция между размером и общей концентрацией метаболитов была более выраженной, чем корреляция для скорости роста (Рис. 2B: P = 0,010, r = -0,646). Как и при сравнении скорости роста, наблюдалась тенденция к положительной корреляции между размером и общей концентрацией метаболитов ( P = 0,068, r = 0,492).

Два основных метаболита в A. armata были бромоформом (10 мкЕ: 85.9% ± 2,0 SE из четырех оцененных; 35 мкЭ: 79,5% ± 2,0 SE) и дибромуксусной кислоты, DBA (10 мкЭ: 10,0% ± 2,0 SE; 35 мкЭ: 17,5% ± 2,4 SE). Корреляция между скоростью роста и конкретными концентрациями метаболитов различалась по силе и знаку для двух основных метаболитов, а также для второстепенных метаболитов. При слабом освещении концентрации трех метаболитов отрицательно зависели от скорости роста, включая бромоформ ( P = 0,017, r = -0,605), дибромхлорметан (CHBr ₂ Cl) ( P = 0.049, r = -0,521) и дибромакриловой кислоты ( P <0,001, r = -0,835). DBA и бромхлоруксусная кислота (BCA) не показали значительной корреляции. Когда водоросли культивировали при умеренном освещении, только два метаболита отражали положительную корреляцию между скоростью роста и общей концентрацией метаболитов, наблюдаемую для общих уровней метаболитов, BCA ( P = 0,027, r = 0,559) и DBA незначительно ( P = 0,070, r = 0,489).Корреляция между основным метаболитом бромоформом имела тенденцию к положительному ( P = 0,204, r = 0,348), тогда как дибромакриловая кислота имела тенденцию к отрицательной ( P = 0,273, r = -0,301).

ANOVA, тестирующий вариацию концентраций метаболитов между двумя уровнями освещенности, показал, что свет имел значительный эффект в большинстве одномерных тестов. Водоросли, выращенные при умеренном освещении, имели более высокие темпы роста ( F _1,14 = 97,96, P <0.001) и более высокие общие уровни метаболитов ( F _1,14 = 21,92, P <0,001), а также более высокие уровни бромоформа ( F _1,14 = 21,00, P < 0,001), CHBr ₂ Cl ( F _1,14 = 6,77, P = 0,012) и DBA ( F _1,14 = 5,15, P = 0,04). Дибромакриловая кислота имела более низкие уровни при умеренном по сравнению с низким освещением ( F _1,14 = 16.96, P <0,001). BCA не различались между видами лечения. Для любого анализа не было значительных взаимодействий между уровнем освещенности и семьями, что означает, что у наиболее быстрорастущих людей при более высоком освещении также были самые высокие концентрации метаболитов.

Сотовые тенденции в распределении ресурсов

Относительный объем клеточного уровня, занятого клетками железы, был значительно меньше в апикальных областях, чем в более старых (менее дистальных) областях роста (Fig. 3, Table 2).Не было разницы в средних значениях между световыми обработками и отсутствием взаимодействия между светом и областью роста (Таблица 2). Однако имел место значительный эффект семьи, указывающий на то, что вариации в объеме клеток железы среди индивидуумов имели тенденцию быть более влиятельными, чем вариации из-за интенсивности света. В самой апикальной клетке не было железистой клетки. Первый уровень клеток, который содержал клетку железы, обычно был на три-четыре клетки ниже апикальной клетки, которые не различались между световыми обработками (2-образец T -тест, P = 0.198, N = 11, 13).

Рис. 3. Эмпирические средние процентного объема (+1 SE) филамента водорослей, который занят клетками железы для апикальных и зрелых клеток вдоль оси.

Результаты представляют собой комбинированные обработки для водорослей, культивируемых под действием фотонов 10 мкмоль m ^-2 с ^-1 и 35 мкмоль фотонов m ^-2 с ^-1. N = 10 человек на сеанс.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0086893.g003

Параметризация и проверка модели

Функции роста модели (уравнение 1 и уравнение 2) параметризовали объемом ярусов клеток и связанных с ними железистых клеток в зависимости от расстояния или положения ниже вершины (что также указывает относительный возраст клеток). Две световые обработки (10 и 35 µE) поддерживали как отдельные модели. Параметры функции плотности, α, и β, в двух функциях роста были скорректированы таким образом, чтобы рост клеток железы и клеточного уровня имитировал данные с погрешностью менее 1% между ростом реального и смоделированного размера (значения параметров см. В таблице 1) .Взаимосвязь между клетками железы и ростом клеточного уровня в зависимости от положения клеток для двух различных уровней освещенности показана на рисунке 4А. Независимо от уровня освещенности, рост клеток железы изначально ниже, чем рост клеточного уровня (<1 по оси Y), соотношение, которое меняется на противоположное по мере старения клеток и дальнейшего удаления из апикального отдела (т.е.> 20 клеток, рис. 4A). . Картина наиболее резкая в условиях низкой освещенности (пунктирная линия), особенно с незначительно меньшими затратами на защиту в вершине по сравнению с умеренно светлыми особями (сплошная линия) (рис.4А). Однако влияние резкого пика в относительном росте клеток железы от положения яруса клеток с 10 до уровня 20 (рис. 4A, как для слабого, так и для умеренного освещения) можно оценить только тогда, когда частота каждого положения яруса клеток рассчитывается с помощью суммирование по нескольким ветвям для каждого отдельного человека (следующий раздел).

Рис. 4. Ключевые модели моделирования, позволяющие различать слабую освещенность (10 мкЕ, пунктирные линии) и умеренную освещенность (35 мкЭ, сплошные линии).

(A) Онтогенетическая траектория относительных вложений в защиту вдоль нити.(B) Объединенный объем клеток железы по сравнению с общим индивидуальным объемом на основе средней частоты ветвей (низкий = 16 и средний = 11 клеток на ветвь). Общий объем клеток железы (%) указывает на общий уровень защиты. (C) Объединенный объем клеток железы в процентах от всего индивидуального объема, связанный с частотой ветвей. Лидеры с более высокой частотой ветвей (слева) снижают общий уровень защиты человека. Обратите внимание, что относительная разница между уровнями освещения уменьшается с уменьшением частоты ветвления (слева направо).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0086893.g004

Масштабирование модели до индивидуума

Включив в модель частоту деления клеток и ветвлений, мы смогли отслеживать объединенные (целые индивидуальные) изменения химической защиты по мере увеличения индивидуума в размерах (рис. 4B). Первая включенная частота ветвей составляла 16 и 11 клеток на ветвь, что соответствовало средним значениям для водорослей, выращенных при 10 мкЭ и 35 мкЭ, соответственно. Уровень защиты (объем целых железистых клеток) всегда асимптотен по мере роста водорослей, независимо от уровня освещенности.Эти асимптоты достигаются, когда существует устойчивое состояние в отношении пропорции различных типов клеток (то есть относительная пропорция апикальных и зрелых клеток больше не изменяется сверх определенного размера). В случае A. armata существует четкая положительная взаимосвязь между размером и долей клеток железы в клеточном уровне вплоть до асимптоты для обоих уровней освещенности (рис. 4B). Это объясняется меньшей долей железистых клеток в апикальных клетках, которые составляют большую часть водорослей на ранней стадии развития.Однако по мере того, как доля зрелых клеток увеличивается во время роста, увеличивается и доля объединенных объемов железистых клеток всего индивидуума (рис. 4B). Поэтому мы прогнозируем, что крупные особи, выращенные при более ярком освещении, будут постоянно иметь более высокий уровень защиты, чем особи аналогичного размера, выращенные при слабом освещении. Этот прогноз, по-видимому, также верен для эмпирических данных, если мы спроектируем корреляцию низкой и умеренной освещенности так, чтобы она пересекалась на оси x (рис. 2B). Эти основанные на размере тренды не зависят от какой-либо стоимости защиты, хотя величина стоимости будет влиять на асимптоту и, следовательно, на весь индивидуальный уровень защиты.

Моделирование диапазона возможных уровней ветвления для двух уровней освещенности показывает, что асимптота процентного объема клеток железы у человека является отрицательной функцией частоты ветвей (частота является обратной величиной числа клеток между ветвями, рис. 4C ). Повышенная доля апикальных клеток во время повышенного ветвления объясняет эту закономерность (меньшее количество клеток на ветвь), которая снижает общий уровень защиты (объединенный объем клеток железы) в устойчивом состоянии. Взаимосвязь имеет тенденцию быть более сильной при слабом освещении, так как эти водоросли имеют несколько меньшие размеры железистых клеток в апикальной области, чем водоросли, выращенные при умеренном освещении (см.рис.3). Мы также обнаружили, что при умеренном освещении асимптота быстро падает, когда на ветвь приходится менее 8–10 ячеек, что аналогично среднему значению эмпирических данных (т.е. b = 11). Эквивалент составляет 14–16 клеток на ветку для водорослей, выращиваемых при слабом освещении, что моделируется соотношением b = 16 (см. Таблицу 1).

За счет исключения стоимости производства клеток железы из ур. 2, модель также использовалась для оценки стоимости защиты для обоих видов лечения светом на основе суммы роста клеточного уровня с зависимостью от размера клеток железы и без нее в уравнении.Он предсказывает, что водоросли, выращенные при умеренном освещении (35 µE), снижают рост особей, который достигает максимума ∼7% для очень маленьких особей, состоящих из 10-40 уровней клеток. Эта стоимость впоследствии снижается примерно до 3% после того, как общий уровень защиты асимптоты снизится, и индивидуумы станут больше в размерах. Более высокая стоимость на ранней стадии развития связана с относительно большим размером клеток железы, когда они впервые формируются (клетки железы сначала присутствуют на 4-8 ярусах клеток под апикальной клеткой). Эквивалентные затраты на водоросли, растущие при слабом освещении (10 µE), ниже и составляют ∼3% и 2% соответственно для маленьких и более крупных особей.Разница в величине затрат между двумя световыми обработками также отражает более высокие альтернативные издержки для особей, растущих при умеренном освещении, по сравнению с более медленно растущими особями при слабом освещении.

Взаимодействие между скоростью ветвления и деления клеток

В предыдущем разделе мы продемонстрировали, что более высокая частота ветвления может привести к более крупным индивидуумам с более низким общим уровнем защиты, что противоположно тому, что было обнаружено в эмпирических данных (которые были более высокими уровнями защиты при повышенном освещении).Однако была также значительная разница между скоростью деления клеток A. armata , выращенных при слабом освещении (10 мкЕ, в среднем 1,3 клетки в день ± 0,24 стандартное отклонение) и умеренном свете (35 мкЕ, в среднем 2,5 клеток в день ± 0,59 SD) ( F _1,5 = 89,05, P <0,001) и значительные различия между семьями, в пределах от 1 до 4 клеток в день ( F _5,36 = 7,89, P <0,001). Маргинальное взаимодействие между светом и семьей ( F _5,36 = 2.22, P = 0,073) предполагает, что различия в скорости деления клеток между индивидуумами будут больше для A. armata , культивированного при умеренном освещении. Эти данные позволили нам ввести время в модель, поскольку увеличение освещенности приводит к более высокой скорости деления клеток с большей разницей между семьями.

Отрицательная корреляция между ростом и уровнем защиты при слабом освещении может быть объяснена различиями в частоте ветвей между людьми (рис. 5A, P = 0.048, r = 0,310). Частота ветвлений является основным фактором роста в этих условиях низкой освещенности, поскольку разница в скорости деления клеток между семьями была небольшой. Следовательно, более крупные, чаще разветвленные индивидуумы имеют более низкую асимптоту совокупного объема железистых клеток индивидуума в целом. Положительная корреляция между уровнями роста и защиты при умеренном освещении может быть объяснена интерактивным влиянием вариаций клеточного деления и частоты ветвлений на характер роста (рис.5B, P <0,001, r = 0,520). При умеренном свете имеет тенденцию к более частому ветвлению (см. Рис. 5A), но, что более важно, существует более высокая дисперсия в скорости деления клеток. Изменяя скорость деления клеток, модель также может быть использована для создания особей совершенно разных размеров, как и раньше, с частотой ветвлений. Это дает другой результат, поскольку создает популяцию особей с разным инвестиционным прошлым на основе относительной частоты апикальных и зрелых клеток (из рис.4А). В этом сценарии большинство самых крупных индивидуумов по-прежнему обладают наивысшим общим уровнем защиты и обеспечивают положительную корреляцию (рис. 5B).

Рис. 5. Моделирование роста (индивидуум в целом — общий объем) и уровней защиты (индивидуум в целом — совокупный объем клеток железы) при слабом (A) и умеренном (B) освещении (n = 40 случайных особей).

(A) При слабом освещении (10 мкЕ) между индивидуумами наблюдается отрицательная корреляция с уменьшением общего объема клеток железы у более крупных (чаще разветвленных) индивидуумов.(B) При умеренном освещении (35 мкЕ) положительная корреляция обусловлена большим разбросом клеточного деления между особями, производящими особей разного размера, независимо от частоты ветвлений. Показаны значимые корреляции ( P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0086893.g005

Обсуждение

Стадия нитчатого тетраспорофита химически защищенной красной водоросли Asparagopsis armata имеет простую осевую форму роста, состоящую из уровней соматических и защитных (железистых) клеток, которые повторяются на всем протяжении индивидуума.Он также имеет простой паттерн роста с клеточным делением из одной апикальной клетки и регулярными событиями ветвления в апикальной области. Эти особенности позволили нам разработать модель дифференциальных уравнений для роста соматических клеток и клеток железы, описывающую результат компромисса в распределении ресурсов для развития каждого клеточного уровня, который затем суммировался в масштабе целых индивидов. . Самым важным открытием было то, что противоположные результаты для роста и химической защиты могут быть получены просто путем манипулирования моделями роста с использованием различных комбинаций частоты ветвлений и скорости деления клеток, полученных на основе эмпирических данных.Рассматривая инвестиции в соматические клетки и клетки желез как две отдельные, но связанные функции роста, мы смогли формально продемонстрировать, что кажущиеся небольшими различия в частоте ветвлений или скорости деления клеток могут привести к сложным — и расходящимся — результатам. Наши результаты показывают, что взаимосвязь между одним ресурсом (светом) и концентрацией основных химических защитных механизмов может быть сложной для организмов с простым строением тела. Таким образом, использование корреляций между отдельными людьми в качестве средства оценки возможных компромиссов между ростом и защитой морских водорослей (например,г. стоимость химической защиты) чревата сложностью взаимодействий, которые, вероятно, действуют в нескольких независимых масштабах, от биохимии сбора, хранения и использования световой энергии в клетках до конкуренции за общие ресурсы между соседними клетками на протяжении всего онтогенеза.

Используя метод моделирования для исследования взаимосвязей между моделями роста и концентрацией конститутивных химических защитных сил в гипотетических сценариях, мы смогли предоставить некоторые уникальные идеи, которые могут дополнить редукционистские подходы к количественной оценке влияния доступности света на конкретные биохимические вещества и / или или рост.Модель помогла нам интерпретировать контрастирующие и слабые связи между доступностью света, ростом и концентрацией химической защиты в эмпирических данных, позволяя выразить локализованные компромиссы на каждом уровне клеток в виде суммы для всего человека. Например, предсказываются положительные корреляции между размером всего индивидуума и защитой, поскольку рост соматических клеток асимптотен до роста клеток (защитных) желез. Однако асимптоты роста также определялись частотой ветвлений, потому что большее ветвление увеличивает соотношение молодых и старых клеток у индивидуума за счет создания новых осей роста.Это означает, что если люди разного размера, но одного возраста являются результатом различий в частоте ветвлений, а не деления клеток (как это было в случае сильного ограничения света), то у быстрорастущих, сильно разветвленных людей относительно больше молодых клеток по сравнению с медленными. растущие особи, когда они маленькие. В этом сценарии ожидается отрицательная корреляция между размером и защитой, потому что у быстрорастущих особей пропорционально больше клеток с более низким уровнем защиты (меньшие клетки железы), чем у медленнорастущих особей.Примечательно, что эти результаты были независимо от наличия ресурсов.

Сложные взаимодействия между уровнями ресурсов, онтогенезом, показателями эффективности, такими как рост, и концентрацией защитных метаболитов препятствовали согласованным и предсказуемым эмпирическим результатам для предсказанных компромиссов, лежащих в основе выделения ресурсов на химическую защиту [3], [5], [ 7], [8]. В недавней литературе внимание к наземным растениям сместилось с демонстрации стоимости химической защиты на анализ того, как индивидуумы управляют затратами на протяжении онтогенеза, в том числе когда компромиссы должны быть выражены или измеримы [8], [42].Однако отсутствие четких компромиссов между ростом и защитой продолжает оставаться препятствием при интерпретации паттернов защиты у морских водорослей (например, [43], [44]), даже несмотря на присущие водорослям свойства (такие как высокая скорость роста и простые планы организма со сложными жизненными циклами) должны сделать их полезными для проверки теорий защиты растений в другой системе. Наша модель объясняет онтогенез распределения по росту и защите у простых нитчатых водорослей, но она также позволила нам выявить ограничения в эмпирических исследованиях стоимости конститутивной химической защиты морских водорослей.И модель, и эмпирические данные демонстрируют всеобъемлющее влияние моделей роста на любой потенциальный компромисс между ростом и конститутивной химической защитой морских водорослей, так что доказательства стоимости будут скрыты на очень ранней стадии разработки. Этот результат не зависел от ограничений ресурсов и был обусловлен высокопластичными моделями роста Asparagopsis armata .

Модель продемонстрировала, что корреляционный анализ стоимости морских водорослей будет неясен у более крупных индивидуумов из-за увеличения относительного количества старых и молодых клеток, что приведет к более высокой асимптоте для индивидуальной защиты из-за соответствующего увеличения инвестиций в защиту, поскольку клетки стареют.Различия в скорости ветвления и деления клеток для A. armata при слабом и умеренном освещении обеспечили достаточные различия в индивидуальном размере, чтобы объяснить наблюдаемые различия в индивидуальной защите в целом. Эта пластическая реакция на стимулы окружающей среды может быть неотъемлемой частью минимизации компромиссов между ростом и защитой быстрорастущих морских водорослей, изменяя модели роста, изменяя ветвление и деление клеток с постоянной обратной связью с окружающей средой и смягчая компромиссы в критических точках во время развития.Наши результаты обеспечивают дополнительную поддержку так называемых «переходных» затрат на защиту — затрат, которые можно обнаружить только на определенных этапах онтогенеза, — которые, как ожидается, минимизируют альтернативные издержки для химически защищенных растений [45]. Однако в нашей системе не произошло резкого сдвига в распределении ресурсов на защиту, а скорее снизились темпы инвестирования в защиту по сравнению с соматическим ростом. Как эмпирические, так и смоделированные данные подчеркивают, что единственным наиболее важным фактором роста и защиты человека является разная скорость инвестирования в защиту между молодыми, активно растущими клетками и старыми клетками.Этот паттерн — квинтэссенция предсказания гипотезы баланса роста-дифференциации (GDBH, [1]).

Если снижение стоимости конститутивной химической защиты в активно развивающихся регионах является косвенным результатом увеличения частоты ветвей в результате увеличения доступности света, то эти тенденции согласуются с GDBH, который способствует росту до защиты. Более того, отсутствие железистых клеток в апикальной клетке A. armata подразумевает небольшой или нулевой компромисс между защитой и делением клетки, что означает, что скорость деления клеток вряд ли ограничена распределением ресурсов.Аналогичная стратегия для наземных растений по минимизации альтернативных издержек в важных регионах роста заключается в задержке производства более дорогостоящих метаболитов. Например, специфические метаболиты отсутствуют на ранних стадиях развития проростков [9]. Мы также обнаружили противоречивые тенденции для конкретных метаболитов у A. armata с разной степенью и силой корреляции между концентрацией метаболитов и скоростью роста, зависящей от уровня освещенности, что аналогично вариабельности между аналогами фуранона в красных морских водорослях Delisea pulchra [12].Если количественные химические данные могут быть подтверждены независимыми измерениями, такими как клеточные данные [12], [40], то это дает дополнительные средства для интерпретации противоположных корреляций между концентрацией метаболитов и ростом.

Изменения в распределении продукции вторичных метаболитов в зависимости от стадии роста важны для моделей защиты, основанных на ресурсах, но их может быть трудно разделить для многих высших растений из-за онтогенеза и перемещения ресурсов между отдельными людьми [1], [8] , [9].Сложности онтогенеза и строения тела у морских водорослей снижены, особенно у нитчатых водорослей, у которых рост происходит из одной апикальной клетки и до размножения происходит небольшая дифференцировка или ее отсутствие. Рассматривая рост соматических клеток и клеток железы как отдельные, но связанные функции, мы смогли отслеживать онтогенез распределения на защиту и суммировать любые затраты на конститутивную химическую защиту для людей с разной историей роста. Модель показала, что следствие распределения затрат в А.armata (снижение роста молодых соматических клеток на 3–8%) было незначительным при суммировании для крупных, сильно разветвленных и, следовательно, пожилых людей. Следовательно, альтернативные издержки (снижение производительности до 10%) можно будет измерить только на очень ранних стадиях развития (например, люди, состоящие из 10-20 клеток), в соответствии с недавним акцентом на изучении затрат на рассаду растений и на ранних стадиях роста растений. наземные растения [9], [45]. Однако нацеливание на ранние стадии роста не гарантирует компромисса, поскольку были обнаружены положительные корреляции между ростом и защитой молодых растений или проростков [45], [46].Одно из объяснений состоит в том, что системные (индивидуальные) компромиссы не связаны между собой у молодых растений, как у морских водорослей, возможно, потому, что отношения источник-поглотитель недостаточно развиты или смещены на определенных этапах онтогенеза. Примечательно, что наблюдаемое нами увеличение конститутивной химической защиты морских водорослей в онтогенезе, как предсказывает GDBH, отражает модель для трав и отличается от древесных растений [42]. Одна из слабых сторон нашего подхода заключается в том, что мы не рассмотрели потенциальный поток, связанный с влиянием ограничений распределения на репродуктивный результат; однако размножение этих водорослей — еще один пример локализованного события, поскольку споры формируются единственной перицентральной клеткой клеточного уровня.Таким образом, размер или общее количество клеток, вероятно, будет наиболее значимым показателем репродуктивной пригодности у A. armata , но это еще предстоит проверить. Другое потенциальное ограничение состоит в том, что избыточная световая энергия может быть захвачена и сохранена в виде гранул флоридного крахмала, что может нарушить любую прямую связь между ростом и концентрацией химической защиты в Asparagopsis ; однако эти высокопреломляющие тела не были очевидны в исследовании и обычно наблюдались только в более старых культурах [30].

Мы представили модель, которая формализует разницу между затратами на выделение сотовой связи и затратами на выделение на рост в масштабе отдельных людей. Что наиболее важно, модель демонстрирует, что если в этих нитчатых водорослях существуют затраты на распределение, то они могут быть ослаблены или ограничены морфологией, и что положительная корреляция между ростом и защитой прогнозируется во многих обстоятельствах. Наши эмпирические и смоделированные данные, как правило, отражают предсказания GDBH, поскольку химическая защита имеет более низкую скорость увеличения, чем соматический рост по оси роста во всех, кроме первых 5-10 клеток, и деление клеток не ограничивается распределением на защиту .Следовательно, затраты на выделение морских водорослей могут быть обнаружены только на очень ранних этапах жизни, после чего компромиссы между ростом и защитой будут скрыты врожденными моделями роста. Однако есть одно предостережение при экстраполяции модели на все водоросли: затраты на распределение не могут быть локализованы для видов, которые имеют рудиментарные системы транслокации (например, ламинарии и другие бурые водоросли [27], [43]) или с сифонной структурой [47]. Несмотря на то, что модель подчеркивает необходимость понимания онтогенеза человека, прежде чем можно будет рационализировать последствия затрат на конститутивную химическую защиту морских водорослей.Факторы, которые влияют на индивидуальный размер и онтогенетическое состояние, в частности, пластичность в ветвлении и скорость деления клеток у Asparagopsis ([34]; это исследование), по-видимому, более важны для уровня защиты человека, чем любые локальные компромиссы. в распределении ресурсов между соматическими клетками и защитными клетками. Способность пластически реагировать на изменение ресурсов может ослабить компромисс между ростом и защитой, а также может способствовать чрезвычайно высокой продуктивности биомассы химически защищенного A.armata , сухой вес> 80 г m ⁻² день ⁻¹, один из самых высоких показателей среди фотосинтезирующих организмов [48].

Благодарности

Мы благодарим двух анонимных рецензентов за их комментарии к рукописи.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: NAP CJS PDS RDN. Проведены эксперименты: NAP CJS. Проанализированы данные: NAP CJS. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: CJS PDS. Написал бумагу: NAP CJS PDS RDN.

Список литературы

1. Herms DA, Mattson WJ (1992) Дилемма растений — выращивать или защищать. Ежеквартальный обзор биологии 67: 478–478.
2. McKey D (1979) Распределение вторичных соединений в растениях. В: Розенталь Г.А., Янзен Д.Х., редакторы. Травоядные животные: их взаимодействие со вторичными метаболитами растений. Нью-Йорк: Academic Press. 55–133.
3. Симмс Э.Л. (1992) Стоимость устойчивости травоядных к травоядным. В: Фриц Р.С., Симмс Э.Л., редакторы.Устойчивость растений к травоядным и патогенам. Чикаго: Издательство Чикагского университета. 392–425.
4. Штраус С.Ю., Руджерс Дж. А., Лау Дж. А., Ирвин Р. Э. (2002) Прямые и экологические издержки устойчивости к травоядным. Тенденции в экологии и эволюции 17: 278–285.
5. Коричева Ю. (2002) Мета-анализ источников вариации стоимости приспособляемости средств защиты растений от травоядных. Экология 83: 176–190.
6. Агравал А.А. (2011) Современные тенденции эволюционной экологии защиты растений.Функциональная экология 25: 420–432.
7. Коричева Ю. (1999) Интерпретация фенотипической изменчивости в аллелохимии растений: проблемы с использованием концентраций. Oecologia 119: 467–473.
8. Боэге К., Маркиз Р.Дж. (2005) Лицом к лицу с травоядными растениями: онтогенез устойчивости растений. Тенденции в экологии и эволюции 20: 441–448.
9. Элгер А., Лемуан Д.Г., Феннер М., Хэнли М.Э. (2009) Онтогенез растения и химическая защита: более старые саженцы лучше защищены.Ойкос 118: 767–773.
10. McConnaughay KDM, Coleman JS (1999) Распределение биомассы в растениях: онтогенез или оптимальность? Тест по трем градиентам ресурсов. Экология 80: 2581–2593.
11. Raven JA (2003) Транспорт на большие расстояния у несосудистых растений. Растительная клетка и окружающая среда 26: 73–85.
12. Dworjanyn SA, Wright JT, Paul NA, de Nys R, Steinberg PD (2006) Стоимость химической защиты красной водоросли Delisea pulchra . Ойкос 113: 13–22.
13. Йормалайнен В., Хонканен Т. (2004) Вариации естественного отбора для роста и флоротанинов у бурой водоросли Fucus vesiculosus . Журнал эволюционной биологии 17: 807–820.
14. Nylund GM, Enge S, Pavia H (2013) Стоимость и преимущества химической защиты красной водоросли Bonnemaisonia hamifera . Plos One 8.
15. Павия Х., Тот Г.Б., Аберг П. (2002) Теория оптимальной защиты: анализ эластичности как инструмент для прогнозирования изменений в защите внутри растения.Экология 83: 891–897.
16. Steinberg PD (1984) Химическая защита водорослей от травоядных — выделение фенольных соединений в ламинарии Alaria marginata . Наука 223: 405–407.
17. Toth GB, Langhamer O, Pavia H (2005) Индуцируемая и конститутивная защита ценных тканей морских водорослей: последствия для приспособленности травоядных животных. Экология 86: 612–618.
18. Wright JT, de Nys R, Poore AGB, Steinberg PD (2004) Химическая защита морских водорослей: наследственность и потенциал отбора травоядными животными.Экология 85: 2946–2959.
19. Cronin G, Hay ME (1996) Влияние света и доступности питательных веществ на рост, вторичный химический состав и устойчивость к травоядным растениям двух бурых водорослей. Ойкос 77: 93–106.
20. Steinberg PD (1995) Сезонные колебания во взаимосвязи между скоростью роста и продукцией флоротаннина в водорослях Ecklonia radiata . Oecologia 102: 169–173.
21. Йетс Дж. Л., Пекол П. (1993) Влияние доступности питательных веществ и травоядности на полифенолы в морских водорослях Fucus vesiculosus .Экология 74: 1757–1766.
22. Амслер С.Д., Фэрхед В.А. (2006) Защитная и сенсорная химическая экология бурых водорослей. Успехи ботанических исследований, Том 43 43: 1–91.
23. Cronin G (2001) Распределение ресурсов в морских водорослях и морских беспозвоночных: образцы химической защиты в связи с защитными теориями. В: МакКлинток Дж. Б., Бейкер Б. Дж., Редакторы. Морская химическая экология CRC Marine Science Series. 325–353.
24. Павия Х, Тот G, Аберг П. (1999) Компромисс между производством флоротаннина и ежегодным ростом естественных популяций бурых морских водорослей Ascophyllum nodosum .Журнал экологии 87: 761–771.
25. Гершензон Дж. (1994) Метаболические затраты на накопление терпеноидов у высших растений. Журнал химической экологии 20: 1281–1328.
26. Брайант Дж. П., Джулкунентиитто Р. (1995) Онтогенное развитие химической защиты с помощью рассады смолы березы: затраты энергии на оборонное производство. Журнал химической экологии 21: 883–896.
27. Diouris M, Floch JY (1984) Транспорт на большие расстояния ассимилятов, меченных C-14, в Fucales — направленность, путь и скорость.Морская биология 78: 199–204.
28. Пол Н.А., де Нис Р., Стейнберг П.Д. (2006) Химическая защита от бактерий в красных водорослях Asparagopsis armata : связь структуры с функцией. Серия «Прогресс морской экологии» 306: 87–101.
29. Пол Н.А., де Нис Р., Стейнберг П.Д. (2006) Взаимодействие водорослей и травоядных в малом масштабе: прямые тесты сдерживания кормления нитчатыми водорослями. Серия «Прогресс морской экологии» 323: 1–9.
30. Пол Н.А., Коул Л., де Нис Р., Штейнберг П.Д. (2006) Ультраструктура железистых клеток красной водоросли Asparagopsis armata (Bonnemaisoniaceae).Journal of Phycology 42: 637–645.
31. Йормалайнен В., Рамзи Т. (2009) Устойчивость бурой водоросли Fucus vesiculosus к травоядным. Ойкос 118: 713–722.
32. McConnell O, Fenical W (1977) Галогенная химия красных водорослей Asparagopsis . Фитохимия 16: 367–374.
33. Verges A, Paul NA, Steinberg PD (2008) Стадия секса и истории жизни изменяет реакцию травоядных на химически защищенную красную водоросль. Экология 89: 1334–1343.
34. Monro K, Poore AGB, Brooks R (2007) Многофакторный отбор формирует зависящие от окружающей среды вариации в клональной морфологии красных водорослей. Эволюционная экология 21: 765–782.
35. Люнинг К (1981) Свет. В: Lobban CS, Wynne MJ, редакторы. Биология морских водорослей Оксфорд: Научные публикации Blackwell. 326–355.
36. Мата Л., Сильва Дж., Шуенхофф А., Сантос Р. (2006) Влияние света и температуры на фотосинтез тетраспорофита Asparagopsis armata ( Falkenbergia rufolanosa ), выращиваемого в резервуарах.Аквакультура 252: 12–19.
37. Provasoli L (1968) Среда и перспективы выращивания морских водорослей. В: Ватанабэ А., Хаттори А., редакторы. Культура и коллекции водорослей — Материалы американо-японской конференции. Хаконэ: Японское общество физиологии растений, Токио. 63–75.
38. Линч М., Уолш Б. (1998) Генетика и анализ количественных признаков. Сандерленд: Sinauer Associates, Inc.
39. Jasienski M, Bazzaz FA (1999) Ошибка соотношений и проверяемость моделей в биологии.Ойкос 84: 321–326.
40. Бьоркман С., Ларссон С., Греф Р. (1991) Влияние азотных удобрений на химию сосновой хвои и продуктивность пилильщика. Oecologia 86: 202–209.
41. Powers SJ, Brain P, Barlow PW (2003) Модели дифференциальных уравнений первого порядка с оцениваемыми параметрами как функциями переменных окружающей среды и их применение для изучения развития сосудов в молодых гибридных стеблях осины. Журнал теоретической биологии 222: 219–232.
42.Бартон К.Е., Коричева Дж. (2010) Онтогенез защиты растений и травоядность: характеристика общих закономерностей с использованием метаанализа. Американский натуралист 175: 481–493.
43. Арнольд TM, Targett NM (2003) Чтобы расти и защищать: отсутствие компромиссов для флортанинов бурых водорослей. Ойкос 100: 406–408.
44. Hay KB, Poore AGB, Lovelock CE (2011) Влияние доступности питательных веществ на толерантность к травоядным растениям у бурых морских водорослей. Журнал экологии 99: 1540–1550.
45. Orians CM, Hochwender CG, Fritz RS, Snall T (2010) Рост и химическая защита саженцев ивы: компромиссы временны. Oecologia 163: 283–290.
46. Бартон К.Е. (2007) Ранние онтогенетические паттерны химической защиты у Plantago (Plantaginaceae): генетические вариации и компромиссы. Американский журнал ботаники 94: 56–66.
47. Cronin G, Hay ME (1996) Внутри растений по вкусовым качествам морских водорослей и химической защите: теория оптимальной защиты по сравнению с гипотезой баланса дифференциации роста.Oecologia 105: 361–368.
48. Mata L, Schuenhoff A, Santos R (2010) Прямое сравнение производительности биофильтров из морских водорослей, Asparagopsis armata и Ulva rigida . Журнал прикладной психологии 22: 639–644.

Сложные паттерны роста клеток плаценты при нормальной беременности и в результате адаптации к ограничению питания матери

Образец цитирования: Eaton M, Davies AH, Devine J, Zhao X, Simmons DG, Maríusdóttir E, et al.(2020) Сложные модели роста клеток плаценты при нормальной беременности и в результате адаптации к ограничению питания матери. PLoS ONE 15 (1): e0226735. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226735

Редактор: Дэвид С. Милстон, Бригам энд Женская больница, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ

Поступило: 6 августа 2019 г .; Одобрена: 3 декабря 2019 г .; Опубликовано: 9 января 2020 г.

Авторские права: © 2020 Eaton et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: данные seq РНК депонированы в GEO под регистрационным номером GSE131729 по ссылке https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE131729.

Финансирование: Работа финансировалась за счет грантов Канадских институтов исследований в области здравоохранения (для JCC, грант MOP-136900) и Alberta Innovates Health Solutions (для JCC).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Плацента представляет собой сложный орган, который объединяет потребность плода в питательных веществах с доступностью питательных веществ для матери [1], а также защищает здоровье матери [2]. Дефицит материнской среды ограничивает доступность питательных веществ и кислорода, что часто приводит к задержке внутриутробного развития (ЗВУР) [3–5], что приводит к низкой массе тела при рождении, повышенному риску перинатальных осложнений и повышенному долгосрочному риску сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний, таких как диабет II типа [6,7].Несмотря на это, не все беременности, осложненные плохой материнской средой, приводят к ЗВУР. Несколько исследований на экспериментальных животных показывают, что плацента хорошо адаптируется, изменяя свое развитие и / или физиологию, чтобы отсрочить или смягчить последствия недостаточной доступности ресурсов [2]. У людей временной анализ ограничен грубыми измерениями физиологии плода и плаценты, что делает модели на животных важным инструментом для ответа на вопросы о влиянии материнской среды на развитие плода и плаценты [8,9].

Хотя общие фазы нормального роста и развития плаценты хорошо известны [10–13], лежащая в основе клеточная динамика менее понятна. Еще менее ясны механизмы, лежащие в основе способности плаценты адаптировать свою структуру и функцию посредством клеточной адаптации перед лицом неоптимальной материнской среды. Плацента мыши состоит из трех отдельных зон; децидуальная оболочка, имеющая материнское происхождение, а также соединительные и лабиринтные зоны, производные от концепта.Зона соединения состоит из гигантских клеток париетального трофобласта (P-TGCs), а также клеток гликоген-трофобласта (GlyT) и спонгиотрофобласта (SpT) [12]. Клетки GlyT хранят энергию в виде гликогена, который, как считается, компенсирует потребность в энергии на поздних сроках беременности [10,14]. Считается, что клетки SpT в основном являются эндокринными по своей природе [15,16] и могут управлять метаболической адаптацией матери к беременности, которая изменяет доступность питательных веществ для плаценты. Зона лабиринта состоит из двух слоев многоядерных клеток синцитиотрофобласта (SynT), которые образуют место обмена питательными веществами и газами и лежащую в основе сосудистую сеть плода.В зрелой плаценте пространства материнской крови в лабиринте выстланы не эндотелиальными клетками, а скорее производными от концептуального синусоидальными гигантскими клетками трофобласта (S-TGC), которые также являются эндокринными клетками. Нормальное созревание и потенциально адаптивные изменения в зоне лабиринта в ответ на изменение диеты частично вызваны геном Igf2 , который регулирует толщину межгемальных клеток и экспрессию транспортеров питательных веществ [17]

Хотя во многих исследованиях описан общий размер отдельных зон плаценты, ни одно из них не рассматривало относительный вклад пролиферации клеток по сравнению с гипертрофией клеток в рост плаценты во время беременности.Размер клетки коррелирует с содержанием ДНК, и клетки становятся полиплоидными в результате эндоредупликации, процесса, при котором клетки проходят циклы репликации ДНК без вмешательства митозов. Эндоредупликация происходит в нескольких подтипах трофобластов в плаценте мыши во время нормального развития [12], особенно в TGCs. P-TGCs могут содержать до 1000 копий ДНК в одной и той же клетке [18], хотя, что интересно, P-TGCs не реплицируют свои геномы равномерно. Определенные области генома P-TGC постоянно недостаточно реплицируются [19], тогда как другие локусы, включая те, которые кодируют специфичные для плаценты полипептидные гормоны, постоянно реплицируются с избытком [20].

Все вышеперечисленные процессы могут изменяться с учетом различий во внутриутробной и материнской среде. Влияние изокалорийной низкобелковой диеты на рост плаценты и плода сильно различается и зависит от модели (например, крыса, мышь, овца) и времени ограничения белка [21–26]. Экспериментальные исследования показали, что кормление беременных самок изокалорийной диетой с низким содержанием белка увеличивает частоту сердечно-сосудистых заболеваний у потомства в постнатальном периоде, особенно у мужчин [27].Используя мышиную модель хронического ограничения белка, начинающегося за две недели до спаривания и поддерживаемого во время беременности, чтобы имитировать хроническое недоедание у людей, мы ранее обнаружили, что масса плода в группе с ограничением белка не отличалась от контрольной до наступления эмбрионального дня (E) 17.5, незадолго до семестра. Напротив, рост плаценты замедлился уже на ст. E10.5 в группе с низким содержанием белка, а матери похудели до ст. E17.5. Различные зоны плаценты не были затронуты в одинаковой степени, при этом соединительная зона вносила наибольший вклад в изменение размера [28].Было уменьшение популяции GlyT-клеток в группе с ограничением белка, но неизвестно, отражает ли это патологический или адаптивный ответ. В предыдущем исследовании не было прямого измерения SpT-клеток, но была затронута экспрессия Prl3a1 , гена плацентарного гормона, связанного с пролактином, который экспрессируется исключительно в SpT-клетках. Интересно, что экспрессия мРНК Prl3a1 была повышена до E17.5, когда плоды все еще росли нормально, но резко снижались к E18.5, когда рост плодов замедлился.

Как генетические и экологические возмущения вызывают клеточные вариации в плаценте — важный вопрос, но на сегодняшний день он часто исследуется без учета пола концептуса. Секс — важный фактор, игнорирование которого может маскировать определенные взаимодействия, влияющие на адаптацию плаценты [29,30]. Например, мужские плаценты значительно тяжелее женских [31], и известно, что различия в размере плаценты зависят от морфологических и функциональных адаптаций [32].Следовательно, неудивительно, что паттерны экспрессии и метилирования генов, расходящиеся по половому признаку, в плаценте были продемонстрированы в ответ на диету кормящих матерей с высоким или низким содержанием жиров [33,34] и в случаях ограничения калорийности [35]. Различия в экспрессии плацентарных генов также связаны с различиями в весе при рождении между полами в моделях ограничения калорий и белков [36,37]. Послеродовые последствия изменения рациона матери во время беременности также являются сексуально диморфными, с различиями в догоняющем росте и метаболизме, которые влияют на послеродовую жизнь [36].

Цели нашего текущего исследования заключались в том, чтобы сначала описать паттерны клеточной пролиферации и эндоредупликации в течение нормального периода беременности, а затем посмотреть, как на эти нормальные паттерны развития и функции влияет хроническая диета матери с низким содержанием белка.

Материалы и методы

Животные

Работа была одобрена Комитетом по охране здоровья животных Университета Калгари (AC12-0094). Мышей содержали в нормальных лабораторных условиях с 12-часовым световым периодом: 12-часовым фотопериодом темноты и неограниченным доступом к пище и воде.Наличие вагинальной пробки определяли как эмбриональный день (E) 0,5. Для исследования нормального развития мышей CD1 (Charles River) спаривали, и беременных самок вскрывали каждые два дня, начиная с эмбрионального дня (E) с 8.5 по E18.5. Мышей C57BL / 6 использовали для оценки влияния низкобелковой диеты во время беременности. Четырехнедельных самок мышей (Charles River) содержали при 12-часовом световом цикле: 12-часовой темный цикл в течение четырех недель. Нерожавших самок случайным образом разделили на две группы и скармливали контрольной (Con) (20%) (Envigo cat.№ TD.

) или с низким содержанием белка (LP) (6%) (Envigo, кат. № TD.) в течение двух недель перед спариванием. После спаривания самок поддерживали на соответствующем рационе до умерщвления. Обе диеты были изокалорийными (3,8 ккал / г), но различались процентным содержанием белка в форме казеина и DL-метионина. Плод и плаценты вскрывали и взвешивали на E13,5, 16,5 и 18,5 (за день до родов). Все процедуры по уходу за животными и процедуры проводились в соответствии с Комитетом по уходу за животными Университета Калгари и медицинскими науками и руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными (протокол AC16-0089).

Вес матери регистрировали до и после рассечения матки. Вес плода и плаценты измеряли сразу после рассечения матки и окружающих тканей. Эффективность плаценты оценивали путем деления индивидуальной массы плода на соответствующую массу плаценты.

Определение пола

У каждого плода был удален небольшой участок хвоста и извлечена ДНК с использованием растворов для подготовки, экстракции и нейтрализации тканей (Sigma).Каждый образец амплифицировали с помощью ПЦР, и присутствие области гена Sry (249 п.н.) указывало на Y-хромосому. Амплификацию последовательности длиной ~ 400 п.н. в гене Hand1 использовали в качестве положительного контроля, чтобы сделать возможным обнаружение ингибирования ПЦР и неудачи экстракции.

Обработка тканей

После вскрытия и взвешивания плаценты были разделены и немедленно зафиксированы в 4% параформальдегиде (PFA) при 4 ° C в течение ночи. Затем ткани промывали 1-кратным фосфатно-солевым буфером (PBS), обрабатывали растворами сахарозы с увеличивающейся концентрацией (10%, 20%) и, наконец, заливали в Tissue-Tek O.C.T. соединение (Электронная микроскопия). Из плаценты делали срезы с использованием криостата Leica CM3050S, срезы размером 20 мкм вырезали, переносили на предметные стекла Superfrost Plus (Fisher Scientific) и хранили при -80 ° C. Чтобы устранить систематическую ошибку, использовалась систематическая случайная выборка для отбора разделов для дальнейшего анализа [38].

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание использовалось для идентификации пролиферирующих клеток на всех срезах плаценты: в частности, трофобласт, фосфогистон h4 / цитокератин 18 (K18), двойной положительный, эндотелиальный, фосфогистон h4 / PECAM1, двойной положительный и перицит, фосфогистон h4 / альфа-актин гладких мышц (Acta2) двойные положительные клетки.Были проанализированы три среза трех плаценты в каждый момент гестации. Срезы оттаивали до комнатной температуры и промывали 1X PBS. Затем их нагревали в 0,01 М цитратном буфере натрия (pH 6,5) для экспонирования антигенов перед блокированием в 5% козьей сыворотке (Cedarlane) в 1X PBS / 1% BSA в течение 45 минут. Первичные антитела (антифосфогистон h4, 1: 100; анти-K18, 1: 100; Фитцджеральд; антифосфогистон h4, 1: 100; Upstate; анти-PECAM, 1: 300; Abcam и анти-Acta2. , 1: 300; Sigma) постепенно наносили в соответствующих комбинациях на криосрезы и инкубировали в течение ночи при 4 ° C.После промывки срезы инкубировали в течение одного часа со вторичными антителами (козьи антимышиные антитела, конъюгированные с Alexa488, 1: 300; конъюгированные с Alexa488 против крысы, 1: 300; оба молекулярных зонда; 1: 300 или козьи антитела, конъюгированные с cy3. кролик, 1: 300; Jackson Immuno Research), в зависимости от комбинаций первичных антител. Окрашивание ядер проводили с использованием бисбензимида 25 мг / мл (Sigma). Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание Ki67 / K18 проводили с использованием той же процедуры, что и описанная выше, с использованием поликлональных антител кролика против Ki67 (Abcam; 1:50) и моноклональных антител человека против K18 (Фитцджеральд; 1: 100).

Расчет длины клеточного цикла

Продолжительность клеточного цикла в различных подтипах клеток трофобласта оценивалась двумя способами: 1) по изменению количества клеток с течением времени исследования; 2) количество двойных положительных клеток по фосфогистону h4 / K18 и Ki67 / K18 следующее:

Предполагалось, что продолжительность фазы G2 / M составляет 0,8 часа, что верно для большинства клеток млекопитающих.

Гибридизация in situ

Фиксированные плаценты дегидратировали с помощью градиентов этанола и ксилола, затем заливали парафином. In-situ Гибридизацию проводили согласно [39]. Для in situ гибридизации по меньшей мере 3 среза по меньшей мере трех мужских и трех женских плацент были проанализированы для каждой группы диеты и стадии развития. Плаценты были разделены пополам около средней линии, и было получено не менее 80 срезов размером семь мкм. По крайней мере, три среза в пределах 240 мкм от предполагаемой средней линии были взяты и проанализированы для каждой комбинации диеты, пола и гестационного возраста. Границы трех основных слоев плаценты были выделены путем гибридизации in situ для мРНК Tpbpa , которая экспрессируется в клетках SpT и GlyT.Клетки SpT и GlyT отличались экспрессией мРНК Prl8a8 и мРНК Pcdh22 соответственно. После гибридизации in situ эти слайды контрастировали с DAPI. Светлопольные и флуоресцентные изображения получали с помощью широкоугольного микроскопа (сканер полного слайда Thorlabs Tide). Общая площадь клеток SpT и GlyT оценивалась путем ручного отслеживания области, экспрессирующей мРНК Prl8a8 и Pcdh22 , соответственно, с использованием ImageJ. Чтобы гарантировать клеточную специфичность, область экспрессии Prl8a8 была наложена на соответствующее изображение DAPI.Затем определяли количество клеток с использованием макроса определения порогов и анализа частиц, написанного для ImageJ. Размер ячеек оценивали путем деления общей площади ячеек на общее количество определенных ячеек.

Оценка содержания ДНК

Срезы тканей депарафинизировали и помещали в DAPI (1 мг / мл), разведенный 1: 5000 в 1X PBS, на четыре минуты с последующей промывкой в 1X PBS в течение двух минут при легком встряхивании. Покровные стекла немедленно устанавливали с помощью монтажного раствора Fluoromount-G (Southern Biotech, Бирмингем, Алабама) на предметные стекла Superfrost + (VWR), и срезы хранили при 4 ° C в течение ночи в темноте.Изображения были получены на Zeiss Axioimager при 20-кратном увеличении. Слайды отображались в случайном порядке, и параметры изображения оставались постоянными на всем протяжении, гарантируя, что интенсивность флуоресценции покрывает полный динамический диапазон камеры. Были получены изображения по крайней мере трех случайно выбранных областей, содержащих P-TGC и SpT-клетки, а также два изображения зоны лабиринта. П-ТГК легко отличить по крупному ядру. Клетки SpT были идентифицированы как клетки между P-TGC и лабиринтом. Чтобы отличить SpT-клетки от Gly-T-клеток, были взяты образцы ядер размером 80–200 мкм ².S-TGCs являются единственным подтипом TGC в лабиринте, и поэтому их легко отличить по размеру ядра. Десять P-TGC, 10 S-TGC и 20 SpT-клеток были выбраны случайным образом, и их ядра отслеживались вручную в ImageJ. Плоидность каждого типа клеток трофобласта оценивали путем деления скорректированной общей ядерной флуоресценции (CTNF) каждой клетки на CTNF амниотических эпителиальных клеток (диплоид = 2C) на том же слайде. CTNF рассчитывалась следующим образом:

Стереология

Три сагиттальных несмежных среза, равномерно расположенных на расстоянии 70 мкм от предполагаемой средней линии плаценты, окрашивали на активность щелочной фосфатазы и контрастировали с ядерно-быстрым красным (Vector Labs, Burlingame, CA).Активность щелочной фосфатазы выражается на апикальной границе SynT (слой I), выстилающей синусы материнской крови после E12.5 [40]. Для каждого концептуса были сделаны четыре разных изображения лабиринта с 40-кратным увеличением. Сетка 10×10 точек была наложена на каждое изображение (S1 Рис). Присутствие либо пространства материнской крови, либо пространства крови плода, S-TGC, SynT-клеток, эндотелия / перицита плода или неизвестного типа клеток оценивалось независимо в каждой точке. Процент точек, перекрывающих каждый элемент, сравнивался между группами.Изображения были количественно оценены двумя слепыми исследователями, и учитывались только групповые различия, которые оставались значимыми между обоими наблюдателями.

КПЦР в реальном времени

Три мужские и три женские плаценты по крайней мере из трех пометов, как при беременности дикого типа, так и при беременности с низким содержанием белка, были вскрыты для выделения РНК (n = 36). Плаценты погружали в 700 мл тризола, обрабатывали ультразвуком и хранили при -80 ° C до экстракции РНК. РНК экстрагировали с использованием наборов RNeasy Mini (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя.Из каждой плаценты экстрагировали 1 мкг / мкл тотальной РНК и объединяли РНК из 3 плаценты / помет. Затем объединенную РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК, и каждый образец разбавляли до 1: 5 водой, свободной от РНКазы, для анализа экспрессии генов с использованием кПЦР в реальном времени. Последовательности праймеров показаны в таблице S1. Относительную экспрессию генов измеряли с использованием метода дельта-дельта Ct с образцами, нормализованными к гену домашнего хозяйства Hprt1 , который стабильно экспрессируется между образцами. Необработанные значения Ct были нормализованы к мРНК Hprt1 и преобразованы в значения Log (1 + x).Затем контрольные образцы нормализовали к единице, и относительную экспрессию в образцах LP выражали в зависимости от этого. Количественный анализ был выполнен на Quant Studio 6 (Applied Biosystems) с использованием обнаружения с помощью SYBR green. Каждый образец был проанализирован в трех экземплярах, и зонды были проверены на эффективность между 0,90 и 1,10, с последующим секвенированием и анализом BLAST для проверки целевой специфичности.

Секвенирование РНК

РНК из цельной плаценты экстрагировали с использованием Trizol, а общую РНК получали из трех однополых однополых однопометников (n = 5).МРНК TruSeq Stranded (Illumina) использовали с 1 мкг тотальной РНК для создания библиотек секвенирования. Библиотеки кДНК были подготовлены для секвенирования с использованием стандартных протоколов Illumina. Данные были депонированы в Gene Expression Omnibus (номер доступа GEO GSE131729; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE131729). Транскрипты были количественно определены с помощью Kallisto 0.43.1 [41] с использованием кДНК Mus musculus GRCh48 (Ensembl release 90), с включенной коррекцией смещения последовательности и 50 бутстрапами.Весь последующий анализ проводился в R 3.5.1 (основная группа R, 2014 г.). Гены, на которые влияет диета (с учетом пола), были идентифицированы с помощью Sleuth 0.30.0 [41]. Тест Вальда использовался для идентификации транскриптов, в большом количестве по-разному, и p-значения транскриптов были агрегированы для каждого гена с использованием метода Ланкастера, как описано в [42], чтобы произвести анализ на уровне генов. Гены, экспрессирующиеся по-разному, были отобраны на основе отсечки скорректированного значения p <0,05. Обогащенные наборы генов как для терминов генной онтологии (GO), так и для путей Reactome 64 [43] были идентифицированы с помощью тестов на репрезентативность (p <0.05) с помощью cluster Profiler 3.10.0 [44] и ReactomePA 1.26.0 [43] соответственно. Кроме того, сетевые графики были созданы в GeneMania [45] для отбора генов, которые были дифференциально экспрессированы (q <0,01) и связаны с терминами фенотипа MGI: «аномальная морфология зоны соединения плаценты» или «аномальная морфология лабиринта».

Статистический анализ

Данные подсчета
клеток из каждой зоны плаценты были проанализированы с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом достоверно значимых различий Тьюки для определения различий между гестационными группами и выявления однородных популяций.Биометрию плода, плаценты и матери анализировали с помощью серии тестов анализа ковариации (ANCOVA). После инициализации каждого ANCOVA как полной модели, содержащей каждый предиктор, модель подвергалась пошаговому обратному отбору до тех пор, пока не была удалена оптимальная модель с незначительными условиями взаимодействия. При нулевой гипотезе о том, что средние значения групп были равны, значение p <0,05 считалось значимым. В то время как зависимой переменной был вес плода, вес плаценты или вес матери, объясняющие переменные включали диету, пол, вес плаценты (исключительно для плода) и их взаимодействие.Для контроля вариабельности между беременностями размер помета и вес матери были указаны как ковариаты. Кроме того, предикторы были сосредоточены на нулевом среднем значении, поскольку различия в масштабировании предикторов могут приводить к ошибочным коэффициентам и интерпретациям. Для других анализов, в которых допущения о нормальности и однородности дисперсии были нарушены внутри стадий и между группами, выполнялся бутстреп с заменой. Статистические данные, полученные с помощью бутстрепа, представляли собой коэффициенты регрессии с использованием диеты и пола в качестве предикторов.Для каждого эффекта была создана серия повторно выбранных (N = 10000) распределений средних коэффициентов при нулевой гипотезе о том, что разница между группами равна нулю. Для каждой загруженной статистики были указаны 95% доверительный интервал и соответствующее значение p. Все многомерные процедуры и процедуры повторной выборки выполнялись в R (R Core Team, 2014).
Результаты
Модели роста плаценты мыши во время беременности
Стереология использовалась для оценки объема нормальной плаценты и ее состава на протяжении всей беременности, поскольку она позволяет просто, точно и беспристрастно извлекать трехмерный структурный состав и пространственное расположение из двухмерных гистологических срезов [46].Абсолютный объем плаценты достиг плато на ст. E16.5 (рис. 1A), хотя скорость увеличения объема плаценты не была равномерной. Резкое увеличение объема примерно в 55 раз произошло между E8.5 и E12.5 по сравнению с 1,4-кратным увеличением объема между E12.5 и E16.5. Резкое увеличение объема плаценты между E8.5 и E12.5 было дополнено увеличением общего числа клеток трофобласта с 1,3 · 10 ⁵ до 9,2 · 10 ⁶. Однако количество клеток трофобласта не изменилось между E12.5 и E16.5, а затем количество ячеек уменьшилось между E16.5 и E18.5 (рис. 1A). Между E10.5 и 12.5 количество клеток в эктоплацентарном конусе / зоне соединения увеличивалось примерно в 10 раз (Рис. 1B). Количество клеток в хорионической пластинке уменьшилось примерно в 4 раза, но это было уравновешено появлением клеток трофобласта в слое лабиринта по мере дифференциации клеток трофобласта хориона.
Рис. 1. Число ядер трофобласта в каждой зоне плаценты мыши, как определено с помощью стереологии.
(A) Абсолютное количество ядер клеток трофобласта и общий объем плаценты. (B) Распределение ядер клеток трофобласта по разным слоям плаценты. (C) Количество ядер трофобласта в слое лабиринта (синие столбцы), а также объем лабиринта (фиолетовая линия) и объем клеток трофобласта (оранжевая линия) от E12.5 до E18.5. (D) Объем клеток трофобласта, рассчитанный как общий объем клеток трофобласта в лабиринте (от C), деленный на количество ядер трофобласта от E12.5 до E18.5. Различные буквенные обозначения указывают на значительную разницу между днями (p <0,05) и действительны как для объема, так и для общего числа трофобластов (n = 3).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226735.g001
Мы количественно определили долю клеток трофобласта, находящихся в клеточном цикле, с использованием антител против Ki67 и фосфогистона h4. Ki67 представляет собой белок, ассоциированный с ДНК-полимеразой, который экспрессируется на ранних этапах G1 и S клеточного цикла [47]. Чтобы отличить митотически активные популяции клеток от популяций клеток, которые подвергались эндоредупликации, мы использовали двойное иммунофлуоресцентное окрашивание на фосфогистон h4 и кератин 18 (K18).Фосфорилирование гистона h4 по серину 10 тесно связано с конденсацией хромосом, феноменом, который происходит во время фазы от поздних G2 до фазы M клеточного цикла [48]. K18 представляет собой промежуточный белок филаментов, который экспрессируется исключительно в клетках линии трофобластов в месте имплантации [49]. До E12.5 86% и 73% K18-положительных клеток трофобласта были Ki67-положительными в хорионе и эктоплацентарном конусе, соответственно (Таблица 1). В хорионе 5,9% K18-положительных клеток были фосфогистон h4-положительными по сравнению с 3.3% в эктоплацентарном конусе (таблица 1). Большая разница между долей окрашивания Ki67 и фосфогистона h4 отражает тот факт, что эпитоп Ki67 экспрессируется на протяжении G1 / S-фазы клеточного цикла (~ 10 часов в клетках трофобласта хориона) по сравнению с эпитопом фосфогистона h4, который выражается только в поздних фазах G2 и M (~ 0,8 часа). Прогрессирование митотического клеточного цикла в хорионе и эктоплацентарном конусе было подтверждено резким увеличением количества клеток трофобласта. В частности, всего за 48 часов количество клеток в хорионе увеличилось с ~ 7.8 X 10 ⁴ до ~ 1,3 X 10 ⁶, тогда как количество клеток в эктоплацентарном конусе увеличилось с ~ 5,3 X 10 ⁴ до ~ 2,9 X 10 ⁵. Скорость развития митотического клеточного цикла не была одинаковой для хориона и эктоплацентарного конуса. Число клеток в хорионе увеличивалось быстрее, чем в эктоплацентарном конусе, и, таким образом, как абсолютное количество, так и доля клеток хориона превышали таковые в эктоплацентарном конусе (Рис. 1B). Эта тенденция подтверждена оценками длины клеточного цикла (таблица S2).На E8.5 клетки хориона и эктоплацентарного конуса в среднем проходили полный клеточный цикл за 9,9 часа и 14,8 часа соответственно.
Между E12.5 и E14.5 наблюдалось уменьшение количества клеток трофобласта в хорионе с 1,3 · 10 ⁶ до 5,6 · 10 ⁵ (рис. 1B), что отражает переход клеток из хориона в компартмент лабиринта и процент клеток в клеточном цикле (таблица 1). Однако частота экспрессии маркеров клеточного цикла оставалась более высокой в хорионе по сравнению с другими зонами плаценты.В хорионе экспрессия Ki67 была обнаружена в 21–34% клеток трофобласта между E12.5 и E18.5, что в 2–5 раз выше, чем в других зонах плаценты (Таблица 1). Точно так же доля фосфогистон-h4-положительных клеток была значительно выше в хорионе по сравнению с другими зонами плаценты (Таблица 1). В то время как подавляющее большинство клеток хориона в клеточном цикле лежало вдоль хорионической пластинки, в лабиринте также были изолированные островки клеток хорионного типа.Морфологически эти клетки были небольшими, кубовидными, плотно упакованными и напоминали клетки собственно хориона.
Было очевидно, что многие из фосфогистон h4-положительных клеток в плаценте не были K18-положительными и, следовательно, не являлись клетками трофобласта. Исследование гистологических срезов на ст. E15.5, время, когда количество дважды положительных по фосфогистону h4 / K18 клеток трофобласта снизилось почти до нуля, показало, что 45 ± 10% фосфогистон-h4-положительных клеток были PECAM-положительными. эндотелиальные клетки и 38 ± 6% были актин-положительными перицитами гладких мышц (S2 фиг.).Фосфогистон h4-положительные клетки крови плода также иногда обнаруживались в кровеносных сосудах плаценты.
Эндоредупликация и гипертрофия популяций трофобластов в плаценте
Сравнивая образцы окраски Ki67 и фосфогистона h4, можно было идентифицировать популяции клеток трофобласта, которые подвергались эндоредупликации (Ki67-положительные, но фосфогистоновые h4-отрицательные) (рис. 2). Напр., Почти все P-TGCs экспрессировали Ki67 на E8.5, но ни один из них не экспрессировал фосфогистон h4, что указывает на то, что эта популяция клеток не была митотической, а, скорее, была эндоредуплицирующейся (Рис. 2). Ki67 не был обнаружен в P-TGCs после E12.5, что указывает на то, что они не продолжают эндоредупликацию после этого момента времени. Хотя были некоторые свидетельства пролиферации клеток на ранней стадии, фосфогистоновые h4-положительные клетки почти не обнаруживались в зоне соединения на E12.5 и E16.5 (Таблица 1 и Рис. 2). Общее количество Ki67-положительных клеток также снизилось после E12.5 (таблица 1 и рис 2). Эти данные предполагают, что, как и TGC, клетки SpT и / или GlyT в соединительной зоне эндоредуплицируются, чтобы стать полиплоидными на ранних сроках беременности.
Рис. 2. Иммунофлуоресцентное окрашивание Ki67 и фосфогистона h4 в P-TGC, соединительной зоне и лабиринте.
Гистологические срезы дважды окрашивали на Ki67 / K18 (красный / зеленый соответственно) или фосфогистон h4 / K18 (красный / зеленый соответственно), а ядра контрастировали с помощью DAPI (синий). Фосфогистон h4 обнаруживался на E12.5 в синусоидальных ТГК внутри лабиринта (белая стрелка; увеличение в 400 раз на вставке), но не в ячейках SynT (красная стрелка). МБС — объем материнской крови; ФБС — кровеносное пространство плода.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226735.g002
В слое лабиринта тонкие клетки SynT практически не показывали фосфогистон h4 или Ki67 окрашивания в любой момент на протяжении всей беременности (рис. красные стрелки). S-TGCs отличались от SynT-клеток в лабиринте на основании их больших клеток и размера ядра, окрашивания K18 и близости к пространствам материнской крови в лабиринте.S-TGCs показали окрашивание Ki67 на E16.5 (рис. 2, белые стрелки) в поддержку предыдущих наблюдений, что эти клетки становятся полиплоидными [12,50], предположительно в результате эндоредупликации. В отличие от P-TGC, в лабиринте было небольшое количество фосфогистон h4-позитивных S-TGC (рис. 2, белая стрелка). Однако при внимательном рассмотрении паттернов окрашивания мы не наблюдали никаких свидетельств метафазных пластинок или анафазного распространения в этих клетках. Это указывало на то, что клетки входили в фазу G2 клеточного цикла и начинали конденсировать свой хроматин, но не переходили в М-фазу.
Анализ лабиринтного слоя показал, что он подвергается сложной регуляции роста. В соответствии со снижением пролиферации клеток трофобласта в хорионе и лабиринте общее количество клеток трофобласта в лабиринте оставалось относительно постоянным после E12.5 (рис. 1C). Несмотря на это, зона лабиринта увеличилась в объеме примерно в 4 раза линейно между E12,5 и 18,5 (рис. 1C). Предыдущие исследования показали, что общий объем компартмента клеток трофобласта в слое лабиринта аналогичным образом увеличивается после E12.5, а плато — на E16.5 [11]. Основываясь на этих данных, мы рассчитали клеточный объем трофобласта (нормализованный к числу ядер трофобласта) и обнаружили, что он увеличился примерно в 5 раз между E12.5 и E18.5 (рис. 1D). Эти результаты показали, что увеличение объема компартмента клеток трофобласта в лабиринте после E12.5 было вызвано гипертрофией клеток трофобласта, а не увеличением количества клеток трофобласта.
Хроническое ограничение белка приводит к половому диморфизму траекторий роста плода и плаценты
Установив характер роста клеток в нормальной плаценте, мы затем оценили эффекты ограничения в питании.Для этого восьминедельных нерожавших самок мышей кормили либо контрольной (Con), либо низкобелковой (LP) диетой в течение двух недель, а затем их смешивали с нормальными самцами. Мы использовали штамм C57BL / 6 на основе их использования в предыдущих моделях диетического ограничения [28,51]. На основании данных, описанных ниже, плаценты C57BL / 6 демонстрировали общую траекторию роста, аналогичную мышам CD1 (S3, фиг.). Время до спаривания и размер помета существенно не различались между контрольной группой и группами с низким содержанием белка. Беременных самок забивали в эмбриональные дни (E) 13.5, 16,5 и 18,5 удаляли матку и регистрировали вес отдельных плодов, плаценты и тела матери без беременности. Как и ожидалось, вес матери без беременности был значительно ниже в группе LP по сравнению с группой Con с E13.5 и далее из-за потери веса матери (p <0,001; n = 10 / группа) (S4, рис.). Степень потери веса матери становилась более серьезной по мере прогрессирования беременности, при этом матери в группе LP становились легче на 17%, 23% и 30% в каждый соответствующий момент времени (p <0.001) (S4 Рис). Чтобы учесть возможные вариации, вызванные другими факторами, был проведен регрессионный анализ с последующим анализом ANCOVA с весом матери и размером помета в качестве ковариант (таблица S3). Несмотря на серьезную потерю веса матери, начиная с E13.5, плоды в группе LP были легче только на E16,5 (p <0,01) и E18,5 (p <0,001) (рис. 3A). Интересно, что плод женского пола был более ограничен в росте, чем мужской, на ст. E16,5 (p = 0,03), но не на ст. Ст. 18,5.
Рис. 3. Вес плода и плаценты, а также соотношение веса плода и плаценты при контрольной беременности и беременностях с ограничением белка в рационе.
(A) Вес плода, разделенный по полу и эмбриональному дню (E). (B) Вес плаценты, разделенный по полу и эмбриональному дню. (C) Соотношение веса плода и плаценты (F: P) с разбивкой по полу и дню зарождения. Объясняющие переменные — диета, пол, помет; Сопоставимые параметры — вес матери, размер помета. Буквенные метки обозначают статистически значимые основные эффекты диеты в течение дней (p <0,05). Основные эффекты секса (если они есть) обозначены символами в соответствующие дни (p <0,05). Никакой диеты по половому взаимодействию не было.Количество концептусов в каждой группе (слева направо): E13.5–28, 32, 41, 39; E16.5–24, 37, 26, 24; E18.5–23, 42, 19, 32.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226735.g003
Поскольку мужские и женские плоды имели разные траектории роста в группе LP, мы предположили, что плаценты также будут иметь сексуально диморфные траектории роста. Дозировка Х-хромосомы (и, следовательно, пол) оказывает значительное влияние на рост плаценты, при этом мужские плаценты тяжелее, чем женские [31].В соответствии с этим увеличение веса и площади поперечного сечения плаценты между 13,5 и 16,5 было меньше у женщин по сравнению с мужчинами, независимо от диеты. В результате женские плаценты стали меньше и легче на ст. E16,5 (p <0,01) и 18,5 (p = 0,01) (рис. 3B). Плаценты в группе LP оказались светлее на E16,5 у обоих полов. Однако эффект диеты был значимым только у самцов LP на ст. E18,5 (p = 0,04). Как и количество и объем клеток в плаценте CD1, траектория веса плаценты C57BL / 6 была двухфазной в группе с диетой Con.Глядя на общую тенденцию в данных, мы видим, что ограничение белка в пище полностью предотвращает двухфазный рост у женщин и сглаживает траекторию роста у мужчин. Поскольку женские плаценты были уже меньше, влияние диеты на вес плаценты было не таким сильным на E18,5 по сравнению с мужчинами. Учитывая это, эффективность плаценты (обусловленная факторами, не зависящими от размера), вероятно, изменилась как в группе диеты LP, так и в зависимости от пола.
Эффективность плаценты поэтому оценивали путем деления веса плода на вес плаценты (соотношение F: P) (рис. 3C).Женские плаценты были более эффективными, чем мужские, независимо от диеты на E16,5 (p <0,001) и E18,5 (p = 0,01). Эффективность у самцов и самок LP была немного ниже, чем у представителей однополого контроля, на E18,5 (p = 0,03 и p = 0,04, соответственно). В этот момент времени (E18.5) оба пола в группе LP ограничены в росте (рис. 3C). Предыдущая работа показала, что рост плода не зависит от веса плаценты после E16.5 [52], поэтому мы хотели подтвердить, существует ли значимая корреляция между массой плода и плаценты на E18.5, учитывая влияние диеты на эффективность плаценты. В соответствии с предыдущим исследованием мы не обнаружили положительной корреляции между массой плода и плаценты на ст. E18,5 в контрольной группе (наклон = 0) (S5, рис.). Напротив, наблюдалась положительная корреляция в группах LP на ст. E18,5, у мужчин и женщин (p <0,01), при этом вес плода LP увеличивался на 0,06 г на единицу увеличения (0,1 г) веса плаценты. Это указывало на постоянную зависимость роста плода от размера плаценты в группе LP по сравнению с Con (S5, фиг.).Однако оставалось неизвестным, коррелирует ли пол плода с массой плода на ст. E18.5. Чтобы ответить на этот вопрос, мы разделили влияние пола и размера плаценты, контролируя их отдельно в модели ANCOVA. При неизменной массе плода не было никакого влияния пола на массу плода при 18,5, показывая, что только масса плаценты коррелирует с массой плода на ст. E18,5. В целом данные показали, что адаптация в ответ на низкобелковую диету, влияющая на массу плаценты, имела большее влияние на более поздних стадиях, при этом специфические для пола эффекты изменяли траектории роста и, в конечном итоге, опосредовали размер и эффективность плаценты.
Модели роста недоедающей плаценты
Учитывая его центральную роль в обмене питательными веществами, мы сначала исследовали слой лабиринта, учитывая как его структурные (размер, состав сосудов, клеточный состав), так и функциональные характеристики (переносчик питательных веществ). Ранее мы не обнаружили различий в размере лабиринта между контрольной диетой и диетой LP [28], но в текущем исследовании мы обнаружили, что площадь поперечного сечения была незначительно меньше у LP женских плацент по сравнению с LP мужской плацентой на E16.5 (p = 0,05) (рис. 4A). Как и вес плаценты, области женского лабиринта в группе LP не увеличивались так сильно, как у мужчин в группе LP, и в целом женские лабиринты были меньше, чем мужские на E18,5 (p = 0,02). Состав лабиринта был определен путем стереологического точечного анализа (таблица 2). Мы использовали окрашивание щелочной фосфатазой, чтобы очертить клетки SynT-слоя I и, следовательно, различать типы клеток, включая: пространство материнской крови (MBS), пространство крови плода (FBS), S-TGC, клетки SynT и эндотелиальные клетки / перициты плода. .В целом, диета и секс не оказали значительного влияния на состав лабиринта между группами на одном и том же этапе. Единственным исключением было то, что относительный объем материнской крови был ниже в женской плаценте на E13,5 и 16,5, по сравнению с мужчинами, особенно в группе LP. Между днями наши результаты показали, что нормальное расширение пространства материнской крови и уменьшение объема крови плода было задержано в группе LP, при этом объем материнской крови в контрольной плаценте увеличился на ~ 6% по сравнению с только ~ 3% в LP. группа.
Рис. 4. Рост лабиринта при беременности с низким содержанием белка опосредуется гипертрофией трофобласта и функцией транспорта питательных веществ.
(A) Общая площадь лабиринта, разделенная по диете и полу (n = 4–5). (B) Экспрессия переносчиков глюкозы и аминокислот в мужской и женской плаценте. Кратное изменение плацентарной экспрессии с ограниченным содержанием белка (столбцы) по сравнению с контрольной диетой в плаценте (пунктирная линия). * р <0,05; ** p <0,01 (n = 3).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226735.g004
В дополнение к общему размеру и составу мы искали функциональные изменения, которые могли бы объяснить более высокую эффективность плаценты у женщин. Анализ RT-qPCR нескольких генов транспортеров питательных веществ показал, что женские плаценты экспрессировали более высокие относительные уровни генов транспорта глюкозы в течение более длительного времени. В мужской плаценте уровень генов-переносчиков глюкозы ( Glut1 / 3 ) на E13.5 в группе LP увеличился примерно в 2 раза по сравнению с группой Con (p <0,05).Однако женские плаценты в группе LP имели примерно в 4 раза большую экспрессию генов транспортеров глюкозы по сравнению с группой Con как на E13,5, так и на 16,5 (p <0,05) (рис. 4B). Экспрессия всех трех оцениваемых генов переносчиков аминокислот ( Slc38a1 / 2/4 ) имела тенденцию к более высокому в женских плацентах (p = 0,05) на E13.5, в то время как Slc38a2 (p = 0,04) и Slc38a4 (p = 0,06) имела тенденцию к повышению у мужчин на E13,5. Мы также измерили экспрессию мРНК Igf2 P0 , лабиринт-специфического транскрипта Igf2 , который, как было показано, регулирует созревание и функциональную адаптацию в лабиринте [53–55].Экспрессия мРНК Igf2 P0 была выше в плаценте LP по сравнению с контролем на E13,5 и 16,5 как у мужчин, так и у женщин (S6 фиг.).
Чтобы получить более полное представление о том, как LP-диета влияет на развитие и / или функцию плаценты, мы выполнили анализ последовательности РНК с использованием образцов РНК из плаценты E16.5 (рис. 5, дополнительные данные). Мы обнаружили, что 72 гена по-разному экспрессировались между группами Con и LP (q <0,05). Анализ главных компонентов показал значительную сегрегацию плаценты Con и LP, но не четкого разделения плаценты мужчины и женщины (рис. 5A).Наблюдался значительный эффект помета, указывающий на различия между беременностями у разных самок, но чем это объяснялось, было неясно. Наиболее дифференциально экспрессируемые гены происходят из множества разных классов (рис. 5B). Чтобы определить, были ли затронуты определенные пути развития, мы исследовали экспрессию генов, которые были аннотированы в базе данных фенотипов Mouse Genome Informatics (MGI) как имеющие мутантные фенотипы с изменениями в морфологии лабиринта и / или соединительной зоны (рис. 5C).Пять генов, связанных с изменениями морфологии лабиринта (MP: 0001716), экспрессировались по-разному, причем мРНК Ccn1 и Hsd17b2 была выше в группе LP, тогда как Tgfbr1 , Tjp1 и Vhl были экспрессированы на более низких уровнях. . Небольшое количество генов, связанных с этими процессами, вероятно, является результатом небольших логарифмических изменений по всему набору данных, а также сильной кластеризации помета, которая, к сожалению, также маскировала специфические для пола эффекты.Это подтвердили результаты нашего теста на обогащение набора генов.
Рис. 5. Анализ секвенирования РНК плаценты Con и LP на ст. E16.5.
(A) Анализ главных компонентов с разными точками, представляющими разный помет (количество) и пол в помете (самец против самки). (B) Тепловая карта дифференциально экспрессируемых генов. (C) Диаграммы генной сети, созданные программой GeneMania, показывающие взаимосвязи между генами, которые активируются (красный) или подавляются (синий) в плаценте LP (n = 5).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226735.g005
Отсроченная гиперплазия и гипертрофия спонгиотрофобластов при истощении плаценты
В дополнение к изменениям в лабиринте, ограничение белка в рационе матери привело к уменьшению площади соединительной зоны, аналогично результатам нашего предыдущего исследования [28]. Мы обнаружили, что это было верно для обоих полов на ст. E13,5 (p = 0,04, Kruskal-Wallace) и 16,5 (p <0,01) (рис. 6A). Эффекты, специфичные для пола, были очевидны на ст. E16.5 и далее. На ст. E16.5 площадь соединительной зоны LP у самок была на 42% меньше у самок и на 20% меньше у самцов по сравнению с контрольной группой того же пола (рис. 6А). На E18.5 соединительные зоны у женщин были значительно меньше, чем у мужчин в обеих диетах (p <0,001). Эффект диеты был менее выражен у женщин на ст. E18,5, поскольку площадь соединительной зоны самок значительно (p = 0,01) между ст. E16,5 и 18,5 в группе Con. Площадь мужской соединительной зоны была стабильной во времени и постоянно меньше в группе LP.
Рис. 6. Клетки спонгиотрофобласта (SpT) способствуют уменьшению размера зоны соединения из-за изменений размера и количества клеток.
(A) Зона стыковки. (B) Общая площадь клеток SpT была измерена на изображении J с использованием автоматического определения порога, различая клетки SpT по экспрессии мРНК Prl8a8 . (C) Число клеток спонгиотрофобласта (n = 4–5).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226735.g006
Затем мы хотели определить, какой тип клеток способствует этим эффектам.Мы количественно оценили общую площадь и количество клеток SpT, разделив эти показатели для оценки размера клеток. При диете Con общая площадь клеток SpT ( Prl8a8, мРНК-положительная область) была двухфазной, увеличиваясь на 33% с E13,5 до 16,5 и затем снижаясь на 26% с E16,5 до E18,5 у обоих полов ( Рис 6B). Повышенное количество клеток было драйвером роста между E13,5 и 16,5 в контроле. В группе LP было стабильно меньше клеток на ст. E13,5 (p = 0,02) и 16,5 (p = 0,01). Группа LP была ближе к контролю на E18.5 из-за уменьшения количества клеток в диете Con, а не увеличения в группе LP. (Рис. 6C). Изменение размера клеток явилось явной движущей силой уменьшения общей площади, при этом клетки SpT были меньше на E18,5 по сравнению с E13,5 во всех группах. Учитывая, что большая часть пролиферации клеток в зоне соединения происходит до E13.5, наши результаты предполагают, что ограничение белка задерживает дифференцировку SpT-клеток от клеток-предшественников, что приводит к меньшему количеству Prl8a8 -положительных клеток на E13.5. Кроме того, SpT-клетки были незначительно меньше в группе LP на E16.5 (p = 0,05) и 18,5 (p = 0,09) (рис. 6D), предполагая, что отсроченная дифференцировка также задерживает рост этих клеток. Во всех группах размер клеток имел тенденцию к уменьшению от E16,5 до 18,5 (рис. 6D), предполагая, что либо более крупные клетки умирали, либо клетки становились меньше после E13.5. Количество и размер клеток были одинаково затронуты у мужчин и женщин.
Другой основной тип клеток в зоне соединения — клетки GlyT. Предполагается, что клетки GlyT накапливают гликоген в больших вакуолях, чтобы компенсировать потребность в энергии на более поздних сроках беременности.Хранение и высвобождение гликогена ранее определяли двухфазную траекторию роста зоны соединения [10]. Наши измерения этого типа клеток показали четкую двухфазную траекторию роста с увеличением общей площади клеток, экспрессирующих протокадгерин 12 ( Pcdh22 ), с ~ 2,5 мм ² на E13,5 до ~ 3,5 мм ² на E16.5 и уменьшается до менее 2,5 мм ² на E18.5 в элементах управления (S7 Рис.). Интересно, что площадь клеток GlyT в группе LP не увеличивалась между E13.5 и 16,5, что приводит к тенденции к снижению с течением времени и значительному снижению положительной области Pcdh22 у обоих полов на ст. E16,5 по сравнению с группой Con (p = 0,03). Самки в обеих диетических группах имели значительно меньшую площадь GlyT-клеток по сравнению с самцами на E18.5, но опять же, нормальное уменьшение площади клеток привело к снижению контрольных уровней до уровней LP, поэтому на E18.5 не было видимого эффекта диеты. Pcdh22 Экспрессия мРНК была снижена у самцов LP по сравнению с самцами Con на E13.5 и повышена у самок LP по сравнению с самками Con на E13.5 и 16.5, не совпадающие с трендом общей площади ячеек (S7 Рис). Чтобы оценить функцию клеток гликогена, мы измерили экспрессию нескольких генов, кодирующих ферменты синтеза гликогена. Интересно, что LP женские плаценты экспрессировали значительно меньше мРНК для гена, кодирующего G be1 (фермент ветвления гликогена) на E13.5 и 16.5 (S6 Fig). Более высокие уровни экспрессии переносчика глюкозы у женщин и более низкая экспрессия фермента разветвления гликогена предполагали, что больше глюкозы транспортируется к плоду, а меньше доступно для накопления в клетках GlyT.
Исследование данных РНК seq показало, что три гена, связанные с морфологией зоны соединения, экспрессируются по-разному (рис. 5C). Из 106 генов, связанных с аномальной морфологией зоны соединения в базе данных фенотипов MGI (MP: 0008957), мы обнаружили, что уровни экспрессии Phlda2 и Hsd17b2 были повышены, в то время как только Egfr были снижены в плаценте LP (p <0,05). ; q <0,1).
Эндоредупликация синусоидальных ТГК и клеток спонгиотрофобласта при беременностях с ограничением белка
Затем мы хотели посмотреть, изменило ли ограничение пищевого белка содержание ДНК в полиплоидных клетках трофобласта.Мы оценили содержание ДНК в клетках S-TGC, P-TGC и SpT с использованием флуоресценции DAPI. Как и ожидалось из наших результатов Ki67, плоидность P-TGC осталась неизменной с E13,5 до 18,5 (S8 фиг.), И диета не оказала никакого эффекта. Средняя плоидность S-TGC увеличилась в плаценте Con и LP с E13,5 (6,12C ± 2,6) до 16,5 (8,20C ± 2,9) (рис. 7), что соответствует низким уровням продолжающейся экспрессии Ki67. Интересно, что плоидность S-TGC продолжала увеличиваться в группе LP, достигнув средней плоидности 11,24 ° C ± 3,19 на E18,5, по сравнению с клетками Con, которые оставались около 8 ° C (среднее значение = 7.96C ± 3,4) при E18,5 (p <0,01). Если клетка прошла через третье удвоение всего своего генома, это будет 16C, но в этом случае данные свидетельствуют о неполной репликации геномной ДНК. Клетки SpT имели более высокую плоидность в группе LP по сравнению с Con, что проявлялось как на E13,5, так и на 18,5 (p <0,01). В частности, клетки в группе LP достигли средней плоидности 9,03 ° C на E18,5 по сравнению с группой Con со средней плоидностью 6,43 ° C (p <0,01). Некоторые клетки в группе Con действительно достигли плоидности ~ 8C на ст. E16.5. Однако эта популяция не сохранялась на E18.5. Половые различия не были значительными.
Рис. 7. Плоидность гигантских клеток синусоидального трофобласта (S-TGC) и спонгиотрофобласта (SpT) при контрольных беременностях и беременностях с ограничением белка.
(A) Частота S-TGC на каждом уровне плоидности во время беременности. (B) Частота SpT-клеток на каждом уровне плоидности в течение беременности (n = 6).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226735.g007
Обсуждение
Это исследование количественно оценило, как различные типы клеток трофобласта способствуют росту плаценты во время нормального развития и в условиях строгого ограничения питания.Во-первых, мы использовали стереологию для количественной оценки количества клеток, сосредоточив внимание на развитии после E8.5, когда гиперплазия способствует быстрому распространению. Затем рост плаценты после E12.5 запускается за счет гипертрофии клеток трофобласта и эндоредупликации в некоторых других типах клеток трофобласта. Затем мы кормили мышей хронической диетой с низким содержанием белка и наблюдали, компенсируются ли и как структура и / или функция плаценты. Несмотря на серьезную потерю веса матери в группе с ограничением белка, рост плода в основном сохранялся до поздних сроков беременности, и что интересно, самцы и самки демонстрировали разные траектории роста.В то время как женские плаценты могли компенсировать свой небольшой размер, становясь более эффективными, мужские плаценты компенсировались расширением зоны лабиринта. Затем мы показали, что дифференцировка и рост SpT-клеток изменяются ограничением белка, что способствует поздней потере массы в зоне соединения. Наконец, мы показали, что ограничение белка приводит к тому, что S-TGC и SpT-клетки достигают большей плоидности на E18.5 по сравнению с контролем.
Паттерны роста нормальной плаценты
Развитие событий на E8.5 отмечают крупный переход в плаценте. Аллантоис контактирует с хорионом, и вместе они образуют лабиринтный слой. В то же время эктоплацентарный конус расширяется, образуя соединительную зону [12]. Наше текущее исследование показало, что эти события сопровождались значительным увеличением количества трофобластных клеток / ядер как в хорионе, так и в эктоплацентарном конусе между E8.5 и E12.5. Чтобы идентифицировать конкретные популяции клеток, которые пролиферируют, мы использовали маркеры, которые позволили нам отличить истинную пролиферацию клеток от эндоредупликации, процесса, в котором клетки реплицируют ДНК, но не проходят митоз и деление клеток.Наши данные показали, что в то время как клетки трофобласта как в хорионе, так и в эктоплацентарном конусе реплицируются, скорость выше в хорионе, что предположительно поддерживает более обширный рост лабиринта по сравнению с зоной соединения. После E12.5, хотя в лабиринте было небольшое количество Ki67-положительных, а также фосфогистон h4-положительных клеток, большинство этих клеток были перицитами или эндотелиальными клетками плода. После E12.5 мы обнаружили, что, несмотря на предсказанный приток предшественников лабиринта из хориона, количество ядер трофобластов в лабиринте оставалось достаточно постоянным.Этот кажущийся парадокс можно объяснить гибелью клеток трофобласта и их обновлением в лабиринте, как это наблюдалось в ворсинах плаценты человека [56], аналогичной структуре плаценты.
После E12.5 мы обнаружили, что объем лабиринта продолжал увеличиваться к сроку, но рост происходил из-за гипертрофии клеток, а не гиперплазии. Поскольку клетки трофобласта в лабиринте сливаются, чтобы дать начало многиядерным клеткам SynT, мы оценили объем цитоплазмы на основе количества ядер клеток трофобласта.Хотя число ядер трофобласта не изменилось резко между E12.5 и E18.5, наблюдалось линейное увеличение объема клеток трофобласта на ядро клетки трофобласта. Аналогичным образом, абсолютный объем лабиринта продолжал линейно увеличиваться до E18.5, хотя и более быстрыми темпами по сравнению с объемом клеток трофобласта после E14.5. Это указывает на то, что между E12.5 и E18.5 рост лабиринта обусловлен не только увеличением объема клеток, но также увеличением внеклеточного пространства.Связано ли увеличение внеклеточного объема с потерей молекул клеточной адгезии [57] и последующим разделением клеток, увеличением количества и / или диаметра кровеносных пространств матери и плода [11,58] или сочетанием того и другого. процессы, еще предстоит выяснить. Наши результаты показывают, что объем материнской крови действительно значительно увеличивается между E13.5 и E16.5.
Интересно, что мы обнаружили ряд популяций клеток трофобласта, которые были Ki67-положительными, но отрицательными по маркеру фосфогистона h4, что позволяет предположить, что эти популяции клеток эндоредуплицируются.Есть по крайней мере пять типов TGCs в плаценте мышей, которые различаются по расположению, происхождению развития и функциям, но имеют общее свойство быть полиплоидными [12]. Наши текущие результаты выявили некоторые различия в сроках и прогрессировании эндоредупликации у разных подтипов клеток трофобласта. Например, P-TGCs эндоредуплицируют свою ДНК только до E12.5. Эти клетки одноядерные, а хромосомы — политены [59]. В соответствии с этим нам не удалось обнаружить экспрессию фосфогистона h4 в P-TGC.S-TGCs становятся обнаруживаемыми в плаценте только после ~ E12.5 [12], и в наших текущих исследованиях они показали экспрессию Ki67 вплоть до E16.5. Другим сюрпризом было то, что мы обнаружили, хотя и с низкой скоростью, экспрессию фосфогистона h4 в S-TGCs, несмотря на предшествующие доказательства того, что S-TGCs являются мононуклеарными и полиплоидными [12]. Во время митотического клеточного цикла эпитоп фосфогистона h4 экспрессируется в поздней фазе G2 с момента начала конденсации хромосом в профазе через метафазу и анафазу. Тщательное изучение S-TGC, которые были фосфогистон h4-позитивными, не показало никаких доказательств существования S-TGC в метафазе или анафазе, что соответствует блокировке митоза.
В дополнение к различным TGCs, наши данные также подтверждают, что эндоредупликация происходит в зоне соединения, что согласуется с предыдущими наблюдениями полиплоидии в зоне соединения у крыс и кроликов [59,60]. Зона соединения, которая возникает из эктоплацентарного конуса, состоит как из клеток GlyT, так и из клеток SpT. Интересно, что Ki67 обнаруживался преимущественно в клетках GlyT в зоне соединения на E12.5, и эти клетки не экспрессировали фосфогистон h4. Это указывает на то, что клетки GlyT не пролиферируют, а вместо этого эндоредуплицируют свою ДНК и делают это перед миграцией из зоны соединения в децидуальную оболочку (10, 58).Низкая частота окрашивания Ki67 в клетках SpT свидетельствует о том, что они достигают своей максимальной плоидности до E12.5 и впоследствии выходят из клеточного цикла. Предыдущие исследования показали, что количество GlyT-клеток между E12.5 и E16.5 увеличивается в 80 раз, а к E18.5 оно снижается на 60% [10]. Однако, если эти клетки не являются митотически активными, увеличение должно быть связано с дифференцировкой клеток-предшественников.
Влияние плохого питания матери на развитие плода и плаценты с половым диморфизмом
Развитие плаценты зависит от множества факторов, которые увеличивают ее способность к адаптации.Ранее показав, что ограничение белка в рационе матери влияет на рост плаценты и вес матери до роста плода [28], мы продвинули эту работу, разделив группы по полу, чтобы учесть обусловленную диетой изменчивость экспрессии генов между полами [30,61 ]. Как и в нашем предыдущем исследовании, рост плода в группе с низким содержанием белка сохранялся намного дольше, чем можно было ожидать, учитывая раннюю и серьезную потерю веса у матери, которая предшествовала общему снижению веса плаценты и площади соединительной зоны.Временное ограничение роста у самок на ст. E16.5 — это новое открытие, касающееся сроков ЗВУР и способности к выздоровлению, демонстрирующее количественный пример самцов и самок, использующих разные стратегии роста в утробе матери. Как и ожидалось, мужские плаценты были больше, в частности, из-за большей площади лабиринта, но, несмотря на это, эти плаценты были менее эффективны, чем женские после E13.5. Предыдущее исследование показало, что более светлые плаценты обладают большей функциональной адаптацией [32]. Однако это исследование не связывало разницу в размерах с полом.Наши находки здесь, что вес плаценты, а не пол плода влияли на рост плода на ст. E18.5, проясняют эту взаимосвязь. Учитывая, что размер плаценты определяется дозировкой Х-хромосомы, мы предполагаем, что у женщин раньше развиваются функциональные адаптации, что делает их более устойчивыми перед лицом уменьшения размера на поздних сроках беременности. С другой стороны, мужчины могут быть более восприимчивыми к факторам, зависящим от размера плаценты, на поздних сроках беременности, но изначально у них не ограничивается рост из-за большей площади поверхности.Когортные исследования на людях показали, что самцы компенсируют ЗВУР за счет роста плаценты на поздних сроках беременности [62], и эта особенность присутствует в некоторых параметрах, измеренных в этом исследовании. Этот тип анализа позволяет нам точно определить источник и время изменения и проинформирует о том, как в дальнейшем будут интерпретироваться плацентарная адаптивность и траектории роста плода. Это также поднимает важные вопросы о том, какой тип плацентарной адаптации может привести к определенным постнатальным изменениям роста и восприимчивости к болезням.
Низкобелковая диета изменяет структуру и функцию зоны лабиринта
Зона лабиринта была логической отправной точкой для количественной оценки функциональных и структурных изменений плаценты, адаптированных к материнской среде. Лабиринт содержит покрытые трофобластом синусы материнской крови и сосудистую сеть плода, которые очень чувствительны к внешним факторам, таким как доступность кислорода и Igf2 [53,63]. Igf2 P0 , хорошо зарекомендовавший себя регулятор зрелости и роста лабиринта [53], был активирован в группах LP.Если предположить, что мужские лабиринты увеличились в размерах, в то время как женские этого не сделали, это говорит о том, что мог быть специфический для пола ответ на Igf2 P0 , обеспечивающий увеличение роста у мужчин и увеличение экспрессии переносчиков питательных веществ у женщин. Затем мы обнаружили, что ограничение белка в рационе матери приводит к уменьшению площади лабиринта у женщин, особенно на ст. E16.5. Поскольку первоначальное формирование зоны лабиринта происходит за короткое время, это энергоемкий процесс, и удивительно, что лабиринт может нормально расти в мужской плаценте, несмотря на серьезную потерю веса матери.Временное ограничение роста у плодов женского пола отражается временным ограничением роста в лабиринте, но другие адаптации, такие как транспорт глюкозы, способны спасти половые различия в росте плода с помощью E18.5. Эти данные свидетельствуют о том, что мужская плацента зависит от площади ее поверхности, чтобы оставаться эффективной, с оговоркой, что одного этого типа устойчивости недостаточно для сохранения роста плода до срока.
Несмотря на то, что влияние диеты на размер лабиринта ограничивается E16.5, мы также обнаружили, что LP-диета задерживает увеличение объема материнской крови в лабиринте.Это напрямую влияет на площадь поверхности, доступную для обмена питательными веществами, предполагая, что без функциональной адаптации ЗВУР последует за этим нарушением. Наши данные, таким образом, предполагают, что половые адаптации определяют траектории роста плода и плаценты, которые устанавливаются ранними различиями в структуре и функции плаценты.
Низкобелковая диета влияет на клетки спонгиотрофобласта и гликоген-трофобласта
Первоначальной целью этого исследования было определить, почему зона соединения меньше при беременностях с ограничением белка.В норме рост зоны соединения двухфазный, увеличиваясь с E12,5 до 16,5 и снижаясь к сроку [11]. Размер и количество клеток как для GlyT, так и для SpT вносят вклад в эту траекторию роста [10], и мы хотели определить, влияет ли ограничение белка преимущественно на один тип клеток. Мы количественно оценили общую площадь клеток SpT и увидели, что она уменьшилась на E13,5 и 16,5, что отражает задержку пролиферации клеток (количество клеток) и роста (размер клеток E16,5). Предыдущие сообщения показывают, что субклеточная сложность SpT-клеток увеличивается во время беременности, что, вероятно, приводит к увеличению транскрипционной способности [50].Учитывая это, уменьшенный размер клеток в группе LP может указывать на то, что клетки SpT менее функциональны. Как в Con, так и в LP диете, клетки SpT не увеличиваются в размере после E13.5, но их количество увеличивается, что способствует росту соединительной зоны. По-видимому, это различие с мышами линии CD1, поскольку количество зон соединения не увеличивалось (рис. 1). У обоих полов количество и размер SpT были уменьшены благодаря низкобелковой диете матери. Другой основной тип клеток в зоне соединения, клетки GlyT, можно обнаружить только после E12.5 и берут начало в эктоплацентарном конусе [64]. После дифференцировки многие GlyT-клетки пролиферируют (E12.5–14.5) и мигрируют в материнскую децидуальную оболочку [10]. В группе LP общая площадь клеток GlyT не увеличилась между 13,5 и 16,5, но все же подверглась апоптозу после E16.5 [65]. Phlda2 Экспрессия мРНК , которая была увеличена в группе LP на E16.5, как известно, ограничивает рост SpT и GlyT клеток и снижает способность накапливать энергию плаценты [14]. Экспрессия гена рецептора эпидермального фактора роста ( Egfr ) также была снижена в плаценте LP. Egfr нокаутные мыши имеют ограниченный рост зоны соединения, но это не объясняет эмбриональную летальность у этих мутантов [66].
Клетки трофобласта эндоредуплицируются, отвечая на ограничение белка увеличением содержания ДНК
Полиплоидизация — хорошо известная особенность TGCs в плаценте, но ее физиологическая функция неизвестна [67]. После того, как пролил свет на механизмы, ответственные за переход в полиплоидное состояние [68], было обнаружено, что P-TGCs имеют слабо упакованный хроматин [69] и избирательно чрезмерно амплифицируют определенные области своего генома [20].Интересно, что эти области содержат гены, кодирующие гормоны, связанные с пролактином плаценты. Эти данные подтверждают теорию о том, что полиплоидизация является недорогим способом увеличения числа копий гена без вмешательства митоза и цитокинеза, что имеет смысл для быстро развивающейся плаценты [18]. В этом исследовании мы использовали маркеры клеточного цикла, чтобы показать, что несколько типов клеток трофобласта, а не только P-TGC, выходят из митотического цикла, но эндоредуплицируются. S-TGCs выстилают материнские кровеносные пространства в лабиринте [15] и напрямую подвергаются воздействию различных уровней кислорода и питательных веществ, в зависимости от их точного положения в лабиринте [58,70].Интересно, что S-TGCs в группе LP имели более высокое содержание ДНК, чем контроли на E18.5. Тенденция предполагает, что S-TGC в нормальной питаемой плаценте становятся меньше или умирают между E16,5 и 18,5, тогда как клетки в группе LP продолжают увеличивать содержание своей ДНК. Наша группа ранее показала, что на экспрессию мРНК Prl3d1 в S-TGC не влияет кратковременное голодание [71]. Однако удаление этих клеток приводило к гибели однопометных однопометных однопометников, что позволяет предположить, что эндокринная функция этих клеток является критической для развития плода [72].
Клетки SpT продуцируют самый широкий спектр гормонов, связанных с пролактином плаценты. В контрольных условиях эти клетки прекращают эндоредупликацию после E12.5. Однако клетки SpT в группе с низким содержанием белка имели более высокое содержание ДНК по сравнению с контролем на E13.5 и 18.5, что указывает на то, что они продолжают эндоредуплицироваться. Наше исследование измеряло только общее содержание ДНК, но мы знаем, что селективные области чрезмерно или недостаточно амплифицированы в P-TGCs по крайней мере [20]. Учитывая, что экспрессия мРНК Prl3a1 повышена при беременностях с ограничением белка до E17.5 [28], эндоредупликация может быть механистической детерминантой увеличения экспрессии гормона.
Как простые правила приводят к сложным образцам
Вычисление теории всего
6 марта 2021 г.
Конечная цель физики — найти теорию всего.
Эта теория будет единой структурой, объясняющей все физические аспекты Вселенной. Прямо сейчас мы можем довольно хорошо объяснить многие аспекты. Но есть одно существенное различие.
У нас есть общая теория относительности, которая очень хорошо работает для больших вещей.У нас также есть теория квантовой механики, которая хорошо работает с очень маленькими вещами.
Но у нас нет возможности их объединить.
Теория всего представляет собой единый набор уравнений, объясняющих все взаимодействия между материей, энергией, пространством и временем.
Это объяснило бы происхождение Вселенной, орбиту Земли вокруг Солнца и все странное квантовое поведение, которое мы продолжаем обнаруживать.
Если задуматься, это действительно кажется немного безумным.Могут ли несколько уравнений действительно все объяснить?
Вселенная невероятно массивна и сложна. Можем ли мы свести все это к небольшой математике?
Ученый-компьютерщик Стивен Вольфрам говорит, что мы можем, и вот как это сделать.
Эмерджентная сложность Вольфрама
У Вольфрама была напряженная и легендарная карьера как в области компьютерных наук, так и в физике, но сегодня мы сосредоточимся только на одном вкладе. Вольфрам доказал, что с помощью нескольких простых правил можно создать сложное поведение.
Возьмем сетку, вот так. Сетка делится на ячейки, и в середине самого верхнего ряда заполняется одна ячейка.
Если мы будем продвигаться строка за строкой вниз по сетке (вторая строка, третья строка, четвертая строка), мы можем генерировать различные шаблоны по разным правилам заполнения ячеек.
Вот пример правила: если та же ячейка в предыдущей строке заполнена, мы заполняем ее в следующей строке. Нажмите «Выполнить» ниже, чтобы увидеть, какой шаблон это сгенерирует.
Не очень интересно, правда? Но мы можем использовать более интересное правило.
Что если мы скажем, что если ячейка слева от ячейки в предыдущей строке (их левый сосед) заполнена, заполните ее в следующей строке?
Теперь у нас есть угловая линия. Еще немного интереснее.
Начнем немного усложнять. В приведенной ниже сетке правило следующее: мы заполняем ячейку, если она была заполнена в предыдущей строке, или если был заполнен любой сосед в предыдущей строке:
Таким образом, мы получаем форму пирамиды.
Фрактальный узор
Новое правило: что, если мы заполним ячейку в следующей строке, если заполнен ОДИН сосед в предыдущей строке, но не оба?
Это фрактальная форма, бесконечно повторяющийся узор.На это приятно смотреть. Это также очень предсказуемо. Он будет повторять один и тот же шаблон снова и снова, если бы у нас было 1000 ячеек или 10000 ячеек.
Случайный узор
Намного интереснее следующий узор. Вот тут-то и начал волноваться Вольфрам.
Здесь правило немного сложнее:
ЕСЛИ либо левый сосед заполнен, либо один из правого соседа или предыдущая ячейка.
Это так называемое «исключающее ИЛИ». Если заполнен левый сосед, но НЕ предыдущая ячейка или ее правый сосед, мы заполняем ячейку.Если левый сосед заполнен И либо из предыдущей ячейки, либо из ее правого соседа, тогда мы этого не делаем.
Другими словами, заполните ячейку , если одно из них истинно, но не оба. : левый сосед заполнен ИЛИ правый сосед заполнен или предыдущая ячейка заполнена .
Посмотрите на образец:
Левая часть этого результата выглядит довольно предсказуемой. Но остального нет. Это вообще не следует шаблону. Фактически, если вы выполните то же правило для 500 строк…
Источник
Или даже 1500…
Источник
… вы можете видеть, что правая сторона выглядит очень хаотичной.На самом деле это совершенно непредсказуемо, или то, что мы назвали бы случайным .
Если бы мы дали вам небольшую часть этой правой части, вы не смогли бы понять, какое правило ее сгенерировало. Казалось бы, безнадежно сложно.
И нам удалось получить этот результат с помощью относительно простого правила. Вот как легко создать настоящую сложность.
Создание собственных шаблонов
Все шаблоны взяты из предыдущей ячейки и ее соседей. Мы можем представить их так:
левый сосед — предыдущая ячейка — правый сосед
Давайте упростим отображение, какие заполнены / незаполнены, используя 1 для представления заполненных и 0 для представления незаполненных.
Итак, если все три ячейки в предыдущей строке заполнены, мы можем назвать это 111 . Если бы все три были незаполненными, это было бы 000 .
Просто левый сосед залил? 100 . Просто середина? 010 .
Есть восемь возможных комбинаций этих трех ячеек. Вот они:
Когда мы определяем правило для нашего шаблона сетки, мы можем представить его с помощью этой таблицы. Например, если действует правило «заполнять ячейку, только если все три ячейки над ней заполнены», мы можем показать это так:
1111
1100
1010
1000
0110
0100
0010
0000
Таким образом, в этой таблице говорится: «заполните ячейку, если все три ячейки над ней заполнены.
Наша фрактальная форма появилась, когда наше правило было «если один сосед заполнен, но не оба». Мы можем показать это в двоичном формате следующим образом:
1110
1100
1010
1001
0110
0100
0011
0000
Этот виджет позволяет создавать свои собственные шаблоны из этой двоичной записи
:
1110
1100
1010
1000
0110
0100
0010
0000
Если вы хотите создать правило, которого мы раньше не видели, попробуйте следующее:
1110
1101 1011
1000
0111
0101
0011
0000
В нижней строке указано «01101110».Это удобный способ написать наши правила.
Попробуйте подключить следующие шаблоны:
Одна строка: 0 0 0 0 0 1 0 0
Пирамида: 1 1 1 1 1 1 1 0
Фрактал: 0 0 0 1 0 0 1 0
Случайно: 0 0 0 1 1 1 1 0
Юниверс из нескольких простых правил
Во всех этих примерах у нас есть один ограниченный ввод: ячейка заполнена или незаполнена. У нас также ограниченное пространство: крошечная сетка.
Несмотря на эти ограничения, мы смогли создать сложные, непредсказуемые шаблоны.
Есть основания полагать, что наша Вселенная может работать одинаково: это целая сложная реальность, созданная на основе нескольких математических правил.
Если вы хотите увидеть эти идеи в действии, ознакомьтесь со статьей Вольфрама «Наконец-то у нас может быть путь к фундаментальной теории физики». и это красиво. Оно длинное и сложное, но объясняет некоторые очень интересные идеи.
Если вас интересуют другие подобные статьи, подпишитесь на мой информационный бюллетень, где я обобщаю лучшее из того, что я написал и читаю каждую неделю:
Как освоить сложные навыки, не разочаровываясь.Подпишитесь на мою рассылку. и подписывайтесь на меня в Твиттере.
Создание сложных паттернов экспрессии генов без регуляторных цепей
Abstract
Синтетическая биология успешно расширила нашу способность конструировать сложные, изменяющиеся во времени генетические схемы, выполняющие точно заданные паттерны экспрессии генов. Однако для таких цепей обычно требуются регуляторные гены, единственная цель которых — регулировать экспрессию других генов. При разработке очень маленьких генетических конструкций, таких как вирусные геномы, мы можем захотеть избежать введения таких вспомогательных генных продуктов.С этой целью здесь мы демонстрируем, что варьирования только размещения и силы промоторов, терминаторов и сайтов расщепления РНКазой в компьютерной модели генома бактериофага достаточно для достижения решений для множества основных паттернов экспрессии. Мы открываем эти решения путем вычислительной эволюции геномов для воспроизведения желаемых целевых паттернов экспрессии. Наш подход показывает, что могут развиваться нетривиальные паттерны, в том числе паттерны, в которых относительный порядок генов по численности изменяется со временем.Мы обнаружили, что одни паттерны эволюционировать легче, чем другие, и разные геномы, которые выражают сопоставимые паттерны экспрессии, могут отличаться по своей генетической архитектуре. Наша работа открывает новые возможности для геномной инженерии за счет точной настройки баланса экспрессии генов и скорости деградации генов.
1 Введение
У всех видов экспрессируемые РНК или белки требуются в разных количествах относительно друг друга, и эта потребность будет также меняться со временем [1, 2, 3]. Таким образом, организмы должны обладать способностью модулировать уровни экспрессии генов для удовлетворения потребностей образа жизни и адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды [4, 5, 6].Многие регуляторные элементы генов хорошо охарактеризованы, и клетки были непосредственно сконструированы для производства индивидуальных белковых продуктов в течение десятилетий; сила промоторов, терминаторов, сайтов связывания рибосом, и т.д.
Совсем недавно область синтетической биологии разработала и достигла успеха в разработке больших, изменяющихся во времени генетических цепей, которые характеризуются сложными взаимодействиями и часто требуют производства генных продуктов, единственной задачей которых является регулирование экспрессии других генов [10 , 11, 12, 13, 14, 15].Хотя масштабы и возможности этих приложений постоянно расширяются [16, 17, 18], возможность конструировать целые геномы с нуля представляет собой огромные проблемы. Одним из конкретных источников проблем является сложность генома — даже самые маленькие свободноживущие организмы кодируют сотни продуктов генов, которые взаимодействуют друг с другом и изменяют паттерны экспрессии генов непредсказуемым образом [19].
Еще более мелкие модельные системы — это вирусы и бактериофаги. Бактериофаги полезны с точки зрения инженерии и дизайна генома из-за их сравнительно небольшого размера, генетической гибкости и потенциального использования в медицинских и биотехнологических приложениях [20, 21, 22, 23, 24, 25].Несмотря на ограниченный набор генов, кодируемых их геномами, фаги, тем не менее, способны продуцировать сложные изменяющиеся во времени паттерны экспрессии генов [26]. Хотя часть этой динамики регулируется сетями промоторов, специфичных для последовательности, и факторов транскрипции, некоторые фаги, такие как Escherichia coli фаг T7, по-видимому, регулируют часть своей транскрипционной потребности с помощью более простой модели вариабельной скорости продукции и деградации. [27, 28]. Полный диапазон динамики экспрессии, который может быть достигнут в течение времени типичной фаговой инфекции, варьируя только эти механизмы в разных генах, в настоящее время неизвестен.
Здесь мы используем модель in silico фаговой инфекции, чтобы рассмотреть диапазон сложности экспрессии генов, который может быть достигнут с использованием только основных регуляторных механизмов, включая транскрипцию, терминацию транскрипта, расщепление транскрипта и деградацию транскрипта. Наш подход основан на вычислительной эволюции геномов с промоторами, терминаторами переменной силы и сайтами расщепления РНКаз для воспроизведения предопределенных закономерностей динамики экспрессии генов. Мы показываем, что с помощью этой модели моделирования на молекулярном уровне можно найти решения для множества нетривиальных паттернов экспрессии генов.Развитые геномы демонстрируют множество различных архитектур генома, даже если они демонстрируют сопоставимые паттерны экспрессии генов. Взятые вместе, эти результаты закладывают основу для будущих усилий по использованию in silico методов эволюционного дизайна для создания новых геномов фагов.
2 Результаты
2.1 Эволюционное моделирование экспрессии фагового гена
Компьютерное моделирование фаговых инфекций с годами становится все более сложным и реалистичным [29, 30, 31, 32].Здесь мы используем недавно разработанную платформу стохастической экспрессии генов (Pinetree), которая моделирует процесс фаговой инфекции в деталях на молекулярном уровне [32]. Мы создали это программное обеспечение, чтобы обеспечить возможность моделирования эволюции, где отдельные поколения состоят из отдельных имитаций фаговой инфекции, а результирующая динамика экспрессии генов является нашим интересующим фенотипом. Специфический для генома вход варьируется от поколения к поколению, поскольку расположение и сила промоторов, терминаторов и сайтов расщепления РНКазами подвержены мутации.В качестве доказательства принципа мы сначала попытались развить геном, чтобы он соответствовал шаблону динамики экспрессии генов, создаваемому произвольно выбранным геномом, который мы впервые смоделировали в Pinetree.
Архитектура генома положительного контроля и паттерн экспрессии целевого гена, полученные в результате однократного моделирования, показаны на рис. 1А (слева). Наше эволюционное моделирование начинается с генома из трех генов, содержащего только один промотор, чей ход экспрессии гена изначально мало похож на целевой.По мере развития поколений предлагаются и условно принимаются единичные мутации в зависимости от того, изменяют ли они результирующий паттерн экспрессии гена, чтобы он больше напоминал мишень (см. Материалы и методы). Более конкретно, мы определяем пригодность мутации как обратную нормированную среднеквадратичную ошибку (RMSE) относительно цели. Отдельные мутации, которые приводят к лучшему соответствию целевому шаблону экспрессии (, т.е. имеют более низкие значения нормализованного RMSE), принимаются с некоторой вероятностью принятия слегка вредных мутаций, чтобы обеспечить эффективное исследование потенциально опасного ландшафта пригодности.
Рисунок 1: Эволюционное моделирование паттерна экспрессии гена положительного контроля.
( A ) «Целевой паттерн» (слева) — это архитектура генома, которая была смоделирована в Pinetree, создавая соответствующий временной ход экспрессии генов (цвета линий соответствуют генам, помеченным в архитектуре генома). Остальные панели иллюстрируют эволюционный процесс: начальную архитектуру генома и соответствующую динамику экспрессии генов (Поколение 0), пример из середины эволюционного моделирования (Поколение 488) и окончательную развитую архитектуру (Окончательный образец).( B ) Соответствующая метрика нормализованного RMSE, показывающая лучшее соответствие цели по сравнению с моделированием поколения 5000.
Как показано на рис. 1A (справа), лучший временной ход экспрессии генов, который развился в ходе эволюционного моделирования 5000 поколений, качественно соответствует цели. Чтобы количественно сделать это определение, мы считаем эволюционное моделирование успешным, если нормализованное значение RMSE конечного времени экспрессии эволюционирующего гена меньше или равно 0.1, что и достигается в данном случае (рис. 1Б). Таким образом, этот положительный контроль показывает, что наш подход способен развивать архитектуры генома, которые соответствуют сложным шаблонам с простых отправных точек. Интересно отметить, что в то время как развитый геном продуцирует паттерн экспрессии гена, который выглядит похожим на целевой (рис. 1A), развитая архитектура генома отличается от входной архитектуры, которая изначально использовалась для получения данных целевой экспрессии.
2.2 Развитие геномов для соответствия ряду паттернов экспрессии генов
После успешного проведения эволюционного моделирования с положительным контролем мы применили тот же метод к ряду паттернов экспрессии генов, которые не имеют априори известных генетических решений.Мы начали с простой схемы, согласно которой численность всех трех генов линейно увеличивается с течением времени, но с разной скоростью. Рациональным решением этого паттерна может быть наличие сильного вышестоящего промотора со слабыми терминаторами между каждым последующим геном. Альтернативным решением было бы начать со слабого вышестоящего промотора с последующими промоторами между каждым геном, чтобы каждый последующий ген экспрессировался на более высоком уровне. В то время как в первом случае, который мы обрисовали в общих чертах, первый ген в геноме будет экспрессироваться с максимальной скоростью, в последнем сценарии последний ген будет экспрессироваться с максимальной скоростью.
Как мы и ожидали, две левые панели на рис. 2B показывают, что мы смогли успешно развить этот линейно возрастающий паттерн и что эволюционированные архитектуры генома соответствуют нашим рациональным ожиданиям. Последние три примера, представленные на рис. 2, дополнительно демонстрируют успешное моделирование (самые низкие значения нормализованного RMSE, найденные в 50 независимых повторах) для более сложных шаблонов, для которых трудно найти рациональные решения. Хотя это демонстрирует, что геномы в нашей системе могут развиваться, чтобы соответствовать нескольким различным шаблонам с качественно успешными решениями, мы хотели еще больше повысить сложность наших целей и более количественно оценивать моделирование репликации.
Рисунок 2: Примеры успешно развившихся паттернов экспрессии генов.
( A ) Каждая панель содержит график изменения времени экспрессии целевого гена, который в совокупности охватывает широкий диапазон возможностей. ( B ) Соответствующие репрезентативные паттерны экспрессии генов из успешного моделирования для каждой соответствующей мишени. Выше показан каждый временной ход экспрессии гена — это эволюционировавшая архитектура генома, которая ее произвела.
Мы провели в общей сложности 300 независимых эволюционных симуляций для каждой из 10 общих закономерностей (рис.3A), разделенных на 50 симуляций для каждого из 6 возможных вариантов расположения генов на паттерн (дополнительный рис. S1, см. «Материалы и методы»). Для конкретной генной компоновки, которая дала наилучшие результаты для каждого паттерна, фиг. 3B иллюстрирует распределение нормализованных значений RMSE из 50 имитаций реплик (дополнительный фиг. S2 показывает соответствующие временные ходы экспрессии генов для наилучшей репликации). У каждого шаблона было по крайней мере два успешных репликационных моделирования (нормализованное RMSE 0,1), но, тем не менее, была четкая разница между тем, насколько легко могли развиваться решения для конкретных шаблонов — сравните и сопоставьте шаблоны № 5 и № 6 на рис. 3B.Этот результат предполагает, что определенные паттерны динамики экспрессии генов могут иметь более ограниченный набор архитектур генома, которые могут их производить, но мы также отмечаем, что эволюционные параметры, возможно, могут быть изменены, чтобы лучше оптимизировать решения для конкретных паттернов.
Рисунок S1:
Для общей картины показаны 6 возможных генных структур. Каждый ген обозначен цветами, показанными в геноме выше: синий представляет ген X, оранжевый — ген Y и фиолетовый — ген Z. Потребность в моделировании расположения 6 генов для одного общего шаблона возникает из-за того, что геномное упорядочение элементов может быть важным и в настоящее время наша симуляция не включает этап мутации, чтобы поменять идентичность отдельных элементов в геноме (что может произойти, когда происходит рекомбинация).
Рисунок S2:
Лучшие временные курсы смоделированного выражения, найденные для целевого шаблона. Ось y содержит каждый из общих паттернов, показанных на фиг. 3, а ось абсцисс показывает 6 возможных расположений генов для каждого паттерна. Каждый из паттернов имеет нормализованное значение RMSE ниже 0,1.
Рисунок 3: Количественная оценка достижимости модели.
( A ) 10 моделей динамики экспрессии целевых генов, которые мы смоделировали, отображаются в виде черных линий, представляющих общие закономерности (каждая из которых имеет 6 возможных структур генов).( B ) Для 50 повторных имитаций каждого шаблона показаны самые низкие достигнутые значения нормализованного RMSE. У всех паттернов было по крайней мере два успешных независимых эволюционных моделирования, как определено красной линией, выделенной значением нормализованного RMSE, равным 0,1.
2.3 Разные архитектуры генома могут повторять один и тот же целевой паттерн экспрессии
Чтобы исследовать возможные различия в достижимости для разных паттернов экспрессии генов, мы исследовали разнообразие успешно разработанных геномных архитектур для каждого паттерна.Мы не обнаружили особой конфигурации генома, на которой сходился бы какой-либо индивидуальный паттерн. Как показано на рис. 4A, даже самый простой паттерн, который мы оценили, имел множество различных (хотя и качественно схожих) геномных архитектур, которые развивались, каждая из которых была способна производить графики экспрессии генов, которые успешно соответствовали цели. Однако некоторые паттерны были более гетерогенными, чем другие, с точки зрения количества найденных возможных архитектур генома (рис. 4B).
Рисунок 4: Разнообразие успешно разработанных архитектур генома.
( A ) Пример успешных архитектур генома для шаблона №1, показывающий, что несколько потенциальных архитектур могут воспроизводить целевой шаблон экспрессии. ( B ) Подобно (A), образец успешной архитектуры для шаблона №5. ( C ) Значения энтропии для набора успешно развившихся архитектур генома для каждого целевого шаблона. Более низкие значения указывают на то, что успешное моделирование репликации сходилось на одной или небольшом количестве архитектур генома.
Мы количественно оценили разнообразие эволюционирующих архитектур геномов для успешного моделирования репликации для каждого паттерна, используя информационную энтропию (выбирая лучший из 6 возможных вариантов расположения генов для каждого паттерна). Более низкие значения энтропии означают, что только одна или небольшое количество различных архитектур генома эволюционировали для определенного паттерна. Напротив, высокие значения энтропии означают, что решения архитектуры генома для определенного паттерна в значительной степени отличались друг от друга.На рис. 4С показаны оценки энтропии для каждого из 10 паттернов, показывающие, что паттерн 5 имел самый разнообразный набор решений генома, тогда как паттерн 10 (который имел только два успешных моделирования) был наиболее ограниченным. Взятые вместе, эти результаты показывают, что определенные шаблоны могут быть более гибкими, чем другие, с точки зрения количества возможных решений, но причина этой изменчивости на данном этапе неизвестна и возможный путь для будущих исследований.
2.4 Эволюционное моделирование десятигенной модели
Хотя трехгенная модель идеальна для изучения основных принципов генетической регуляции, размер этого генома непрактично мал по сравнению с большинством фаговых геномов.Таким образом, мы хотели проверить, способен ли наш подход к моделированию эволюционировать более крупные геномы, содержащие до 10 генов. Как показано на рис. 5, мы достигли качественно подходящего результата при попытке смоделировать простой линейный паттерн с переменной скоростью для каждого гена в геноме. Однако мы отмечаем, что увеличение количества генов в геноме также существенно увеличивает время выполнения моделирования, поскольку требуется большее количество поколений для адекватного изучения ландшафта приспособленности, учитывая, что существует гораздо больше возможных мутаций ( i.е. областей между генами, которые потенциально могут содержать регуляторные элементы). Этот результат, тем не менее, показывает, что наш подход является обобщаемым и, в принципе, может быть распространен на любое количество генов со сложными предопределенными целевыми паттернами без вычислительных ограничений.
Рис. 5: Эволюционное моделирование модели из десяти генов.
( A ) Показаны целевой (слева) и усовершенствованный (справа) шаблоны. Разработанный паттерн — это лучший из 5 независимых реплик, каждая из которых была смоделирована для 100 000 поколений.( B ) Начальная (вверху) и наиболее подходящая (внизу) развитая архитектура генома.
3 Обсуждение
Геномы всех видов используют множество регуляторных стратегий, чтобы гарантировать, что отдельные гены экспрессируются на определенных уровнях, которые меняются с течением времени. Здесь мы использовали компьютерное моделирование, чтобы продемонстрировать, что бактериофаги могут генерировать ряд сложных и изменяющихся во времени паттернов экспрессии без необходимости в конкретных регуляторных молекулах или сложных генетических схемах.Варьируя только силу промоторов, терминаторов и сайтов связывания РНКаз, наша эволюционная платформа in silico смогла создать геномы, способные соответствовать многочисленным и различным моделям экспрессии генов во времени. Эти результаты показывают, что сети взаимодействующих промоторов и факторов транскрипции явно не необходимы для достижения определенных дизайнов экспрессии генов, и обеспечивают доказательство принципа de novo дизайна и конструирования фаговых геномов с использованием эволюционного моделирования на молекулярном уровне.
Геномы фагов, как правило, небольшие и с высокой плотностью генов, что, вероятно, ограничивает общую сложность программ экспрессии их нативных генов [33, 34]. Фаг PhiX, например, кодирует только 11 основных генов в геноме, который охватывает 5000 пар оснований [35, 36]. Даже с относительно небольшими геномами фаги, тем не менее, способны производить сложную динамику экспрессии генов в течение цикла инфекции. Например, в фаге T7 гены, которые экспрессируются на ранней стадии инфекционного цикла, обычно участвуют в остановке синтеза макромолекул клетки-хозяина, тогда как гены, которые экспрессируются позже, играют роль в сборке и лизисе вируса [37, 38, 39] .В то время как геном Т7 кодирует свою собственную полимеразу, которая имеет решающее значение для отсроченной экспрессии этих поздних генов, динамика экспрессии гена фага Т7 частично достигается за счет регуляторных свойств переменной силы, которые разбросаны по всему геному [29, 40, 27, 41, 42, 28].
Наши результаты здесь подчеркивают некоторые сильные стороны и ограничения нормативных подходов, построенных исключительно на этих простых элементах. Помимо накопления с разной скоростью с течением времени, генные продукты могут выходить на плато на разных уровнях путем настройки скорости деградации.В наиболее сложных случаях, которые мы исследовали, комбинация переменных скоростей продукции и деградации достаточна для получения динамики экспрессии, посредством которой относительный порядок генов по численности может меняться со временем (рис. 3, паттерны 7-10). Однако регулирующие элементы, которые мы оценили, не предоставляют средств для отключения продукции определенных генов, что могло бы привести к снижению абсолютного количества транскриптов в определенные моменты времени. Точно так же задержки экспрессии генов в этой системе ограничены короткими временными рамками, когда геном фага все еще вводится; не существует очевидного механизма для индукции экспрессии в определенное время без учета более сложной генетической регуляции.
Несмотря на эти ограничения, наш подход может обеспечить важное понимание общей организации и регуляторных принципов, управляющих геномами фагов. Например, сайты расщепления РНКазой и промоторные последовательности часто встречаются в фаге Т7 [28]. В нашем моделировании мы наблюдали многочисленные случаи этого совпадения, но общность и значимость этого открытия трудно оценить, основываясь на ограниченном наборе паттернов, которые мы исследовали. Дальнейшая работа, особенно сосредоточенная на больших геномах с более сложными паттернами экспрессии, может раскрыть интересные принципы дизайна, которые до сих пор оставались незамеченными.
В то время как наши результаты дают представление об ограничениях и возможностях стратегий регуляции фагов, наш подход может также оказаться полезным для приложений синтетической биологии на фагах [43, 44]. Синтетические генетические цепи обычно разрабатываются для свободноживущих видов, где они должны работать в различных клеточных контекстах в течение сравнительно длительных временных масштабов [45, 46]. Напротив, фаговые инфекции обычно кратковременны, с соответствующими временными шкалами порядка десятков минут [47, 48]. Мы выполнили моделирование с реалистичными клеточными параметрами в течение начального 5-минутного периода заражения.Создание более сложной динамики из гораздо более крупных геномов в более длительных временных масштабах, в принципе, может быть достигнуто с использованием минимальных генетических схем для разделения генома на ранние и поздние наборы генов; в пределах каждого из этих двух наборов наши результаты показывают, что можно кодировать разнообразную динамику без каких-либо дополнительных регуляторных механизмов. Действительно, геном фага Т7 разделен именно таким образом, имея различные классы ранней, средней и поздней экспрессии генов, которые выполняют разные функции [37, 38, 39].
В принципе, представленный здесь подход может быть адаптирован к структуре, ориентированной на дизайн, но при этом возникает несколько проблем. Хотя Pinetree полагается на информацию на уровне генома, она не использует информацию уровня последовательности . Такие элементы, как промоторы, кодируются исключительно их местоположением и силой, а не явной последовательностью. Таким образом, преобразование конкретного эволюционного дизайна в реальную последовательность генома потребует использования стандартизованных частей с предопределенной силой элементов, которые можно было бы откалибровать по значениям, закодированным в Pinetree [49].В случае сайтов РНКаз это может быть особенно сложно, потому что, хотя известно, что скорость деградации значительно варьируется в зависимости от генов, общие правила, касающиеся связывания и расщепления РНКаз, менее понятны, чем действия промоторов и терминаторов [50, 51].
Мы предполагаем, что представленные здесь результаты могут быть расширены в ряде различных направлений в будущих исследованиях. Во-первых, в нашем исследовании мы рассматривали только неперекрывающиеся гены, но многие фаговые геномы очень компактны, и последовательные гены часто перекрываются; эта особенность может влиять на экспрессию генов способами, которые трудно предсказать, но их можно оценить с помощью нашего подхода [33, 23].Во-вторых, очевидным способом создания более сложной динамики экспрессии генов было бы кодирование регуляторного белка в геноме фага, а не произвольных белков, которые мы до сих пор исследовали. Расширения нашей структуры для рассмотрения большего количества генов, вероятно, выиграют от такого подхода, который может допускать задержки экспрессии или снижение численности. В-третьих, мы ранее отмечали, что порядок генов может играть важную роль в достижении конкретных целей. Имея всего три гена, мы смогли перечислить все возможные структуры генов, но этот подход неосуществим для больших геномов и потребует дополнительного мутационного шага, который меняет расположение генов для более крупных приложений.Наконец, мы сосредоточили наше внимание на изобилии транскриптов, но различия в скорости инициации трансляции и элонгации предлагают дополнительные способы настройки экспрессии генов на уровне белковых продуктов для получения более сложной динамики [8, 7].
За последние годы было обнаружено необычайное количество фагов, но лишь небольшое количество из них было исследовано экспериментально [52, 53, 54]. Вычислительные подходы могут помочь лучше охарактеризовать общие ограничения и принципы, которые влияют на организацию и функцию генома, а также могут дополнительно предоставить способ конструирования фагов на основе заранее определенных конструктивных ограничений.Дизайн и инженерия полных фаговых геномов с использованием принципов и подходов, которые мы здесь разработали, могут иметь ряд будущих медицинских и биотехнологических приложений, включая борьбу с устойчивыми к антибиотикам бактериями [55].
4 Материалы и методы
4.1 Моделирование соснового дерева
Для моделирования фаговой инфекции Pinetree (v0.3.0) требуется несколько частей информации: i) длина генома, ii) начало и конец каждого ген и iii) расположение, размер и сила промоторов, терминаторов, сайтов связывания рибосом и сайтов расщепления РНКазой.Кроме того, Pinetree также требует разнообразной информации на клеточном уровне об инфицированных бактериях: i) объем клетки, ii) скорость, концентрация и размеры отпечатков полимераз и рибосом в клетке, и iii) скорость обработки и размер РНКазы. молекулы. Общее время, в течение которого будет отслеживаться процесс заражения, является дополнительным бесплатным параметром, мы смоделировали 5-минутный период заражения в этой рукописи, но обратите внимание, что более длительные циклы заражения и более крупные / более сложные геномы потребуют более длительного времени выполнения.
Некоторые из вышеупомянутых параметров имеют физиологические или вычислительные ограничения. Чтобы определить эффективные диапазоны отдельных элементов, мы смоделировали упрощенные геномы и измерили реакцию экспрессии нижележащих генов (дополнительный рис. S3), используя модель генома, содержащую только три кодирующие последовательности. Каждая кодирующая последовательность имела длину 150 нуклеотидов, что соответствовало белкам длиной 50 аминокислот (ни один из которых не выполнял функции в рамках моделирования). Размеры участков связывания промотора (и, следовательно, следов полимеразы), терминаторов, участков связывания РНКаз и следов рибосом были установлены на физиологически реалистичные значения длиной 35, 30, 10 и 30 нуклеотидов, соответственно.Та же самая конфигурация генома также использовалась в качестве исходного генома для эволюционного моделирования, описанного в этой рукописи.
Рисунок S3:
Анализ эффективного диапазона силы отдельных элементов. Каждый график соответствует одному из трех элементов, в которых их эффекты при разной силе анализировались путем сравнения соотношения гена Y и гена X (нормализованное содержание транскриптов). Архитектура генома над графиками показывает расположение элементов при анализе их сильных сторон.Серая пунктирная линия обозначает силу, с которой мы решили вставить каждый соответствующий элемент в наше эволюционное моделирование, когда предлагается «добавить» мутацию.
Мы отмечаем, что сила связывания РНКазы была ранее жестко запрограммирована в предыдущих выпусках Pinetree, что фактически давало каждому транскрипту одинаковую среднюю скорость деградации. В последнем выпуске мы изменили это поведение и теперь позволяем указывать сайт-специфичные скорости для каждого сайта расщепления РНКазой. Эту скорость можно рассматривать как составной параметр, который включает как скорость связывания молекулы РНКазы, так и скорости энзматического расщепления (каждая из которых может проявлять специфичность последовательности).
4.2 Эволюционное моделирование
Наше эволюционное моделирование состоит из серии повторных обращений к Пинетри с использованием мутировавших геномов фагов. В дополнение ко всем типичным параметрам соснового дерева, описанным выше, для эволюционного моделирования также требуются: i) данные об экспрессии целевого гена, ii) файл с исходной информацией о геноме, iii) количество поколений, для которых нужно запустить моделирование, и iv) количество поколений. реплицируйте моделирование Pinetree для усреднения в каждом поколении. Примеры всех входных файлов и параметров моделирования включены в репозиторий кода.
В нашем исследовании мы начали моделирование эволюции с исходного генома, который состоит из одного промотора средней силы, расположенного выше трех кодирующих последовательностей одинакового размера, как описано выше. Мутации предлагаются путем выбора либо i) добавления, ii) удаления, либо iii) модификации существующих сильных сторон регулирующих элементов из равномерного распределения всех возможных вариантов. Функции добавления и удаления действуют как инсерционные и делеционные мутации, соответственно, тогда как мутации переменной силы аналогичны точечным мутациям, которые изменяют определенные параметры скорости.Как только предлагается мутация, новый геном моделируется с помощью Pinetree для получения графика экспрессии гена. Для каждой предложенной мутации мы запускаем 10 независимых симуляций соснового дерева и усредняем результаты, чтобы избежать выбора стохастического шума в отдельных симуляциях соснового дерева. Затем результаты этих усредненных симуляций определяют, принимать ли данную мутацию.
4.3 Расчет пригодности
Мы использовали упрощенную модель эволюции с фиксацией происхождения для расчета вероятностей принятия для отдельных мутаций в дискретных, неперекрывающихся поколениях, которая основана на ускоренном алгоритме для ограничения количества дорогостоящих в вычислительном отношении обращений к платформе Pinetree. [56].Любая мутация, которая увеличивает приспособленность в поколении и , будет принята, тогда как мутации, приводящие к снижению приспособленности, вряд ли будут приняты в соответствии с: где N _eff — эффективный размер популяции, а x _i — преобразованное логарифмическое значение пригодности:
Здесь β аналогично значению температуры, которое позволяет нам настраивать силу отбора, и мы вычисляем приспособленность непосредственно из нормализованной средней квадратичной ошибки (RMSE) для данного поколения: где T — количество временных шагов в зависимости от времени экспрессии гена, y _t — это количество гена в смоделированных данных и — это количество гена в целевых данных на каждом временном шаге.Рассчитываем RMSE отдельно для каждого гена, нормализуем эти значения на среднюю целевую численность (nRMSE): и, наконец, усреднить значения nRMSE по генам, чтобы получить общую nRMSE для данной архитектуры генома, используемой в уравнении. (2). Подробнее об этом эволюционном подходе см. [56].
В реализованном вычислении пригодности мы зафиксировали эффективный размер популяции на уровне 1000 и изменили β от 10e-3 до 1,3 для 5000 смоделированных поколений. Мы сделали это по частям, где β начинается со значения 10e-3 для первых 10% поколений, чтобы шумно исследовать ландшафт фитнеса (дополнительный рис.S4). Затем значение β линейно увеличивается до значения 1,1 до тех пор, пока не завершится 90% поколений, и, наконец, увеличивается до значения 1,3 для оставшихся поколений моделирования. Такой подход к моделированию отжига позволяет гарантировать, что вредные мутации будут менее часто приниматься к концу моделирования по сравнению с началом, и что отдельные моделирования будут в значительной степени основываться на одной архитектуре генома. Значительные изменения вышеупомянутых параметров могут привести к моделированию, которое либо неспособно развиваться в направлении более высокой приспособленности (выбрано слишком много вредных мутаций, и приспособленность сильно варьируется от поколения к поколению), либо застрять в локальных оптимумах приспособленности (слишком мало вредных мутаций будет выбрано).Наша цель в этом дизайне заключалась не в том, чтобы воспроизвести истинный эволюционный процесс, а просто в том, чтобы дать возможность эффективно исследовать потенциально опасный ландшафт фитнеса и максимально увеличить наши шансы найти подходящую архитектуру генома.
Рисунок S4:
Влияние параметра β на силу выбора. ( A ) Мы зафиксировали эффективный размер популяции на уровне 1000 и выполнили моделирование 5000 поколений со значением β , изменяющимся от 0,001 до 2,000. На каждом графике показаны представители 10 моделей паттерна №1.( B ) Мы суммировали подзаголовок (A), нанеся на график долю принятых мутаций, которые были вредными для каждого значения β . ( C ) Мы остановились на изменении β в ходе каждого моделирования, причем этот график показывает кусочную функцию, где β остается постоянным в течение первых 10% поколений, линейно увеличивается до тех пор, пока не пройдут 90% поколений. , а затем линейно увеличивается с разной скоростью в течение последних 10% поколений.
4.4 Создание целевых паттернов экспрессии генов
Мы начали наше исследование паттернов экспрессии генов, допуская переменные скорости продуцирования в течение цикла заражения продолжительностью 300 секунд (5 минут). Затем мы ввели понятие «плато» в данных экспрессии для отдельных генов, которое происходит, когда количество конкретного транскрипта остается стабильным по мере развития цикла инфекции (, т.е. продукции и деградации сбалансированы). Мы создали паттерны, в которых количество транскриптов выходило на плато сравнительно рано (150 секунд) и поздно (200 секунд) в 300-секундном цикле заражения.
4.5 Учет возможных перестановок генов
Для простого случая общей картины, когда один ген экспрессируется с высокой скоростью, один ген со средней скоростью и один ген с низкой скоростью, идентичностей гены, экспрессируемые с разной скоростью, могут различаться. Другими словами, первый ген в геноме может быть выбран для экспрессии на высоком, среднем или низком уровне. Точно так же, при конкретном выборе первого гена, второй ген может экспрессироваться на одном из двух возможных уровней.В целом, существует 6 возможных комбинаций для сопоставления 3 генов в геноме с 3 генами, описанными в любом общем шаблоне. Вместо того, чтобы включать шаги перестройки генов, мы просто смоделировали все 6 возможностей для каждого общего паттерна. Мы выбрали структуру генов с наименьшим средним нормализованным RMSE в качестве представителя для каждого паттерна, изображенного на рис. 3.
4.6 Удаление элементов с незначительными функциями
Когда эволюционное моделирование основывается на конкретной архитектуре генома, мы хотели проверить что каждый элемент, содержащийся в этой архитектуре, оказывает значительное влияние на общий паттерн выражения.Если сила какого-либо отдельного элемента была изменена до значения, при котором она практически не оказала никакого влияния, этот элемент следует удалить, чтобы можно было проводить сравнение между архитектурами (как на рис. 4). Чтобы оценить эффект каждого элемента, мы сначала удалили этот элемент из генома, смоделировали мутировавший геном с помощью Pinetree и сравнили смоделированный образец экспрессии с образцом экспрессии, созданным с помощью элемента на месте. Если значение нормализованного RMSE увеличилось на несущественное значение (с использованием порога 0.1) или, если значение уменьшилось, мы добавили бы его в список элементов, которые потенциально могут быть удалены. После того, как список из съемных элементов был составлен, мы удалили элемент, удаление которого оказало наименьшее влияние. Затем мы повторили этот процесс, жадно удаляя элементы один за другим, пока удаление элемента не оказало существенного эффекта и, таким образом, не остановило процесс.
4.7 Вычисление энтропии растворов генома на основе имитационных реплик
Каждый целевой шаблон, который мы моделировали, приводил как минимум к двум, а иногда и многим независимо эволюционирующим геномам, которые были способны сопоставить его.Чтобы количественно оценить разнообразие полученных решений архитектуры генома, мы использовали меру информационной энтропии. Сначала мы преобразовали каждую архитектуру генома в строку, представляющую присутствие / отсутствие каждого элемента вдоль генома (независимо от силы), и подсчитали, сколько раз развивалось каждое представление (используя только успешные симуляции). Затем для каждого из n наблюдаемых паттернов мы преобразовали эти частоты в вероятности ( p _i ) и вычислили энтропию архитектур для конкретного паттерна как:
Результирующие единицы энтропии (при вычислении с основанием 2) выражаются в «битах».
5 Благодарности
Эта работа была поддержана грантами F32 GM130113 Национального института здравоохранения, выданными A.J.H. и R01 GM088344 на имя C.O.W. Авторы также благодарят Техасский центр передовых вычислений (TACC) Техасского университета в Остине за предоставление высокопроизводительных вычислительных ресурсов и исследовательскую стипендию TIDES за поддержку S.B.S.
Рой и формирование сложного паттерна в вихре Paenibacillus изучено с помощью визуализации и отслеживания клеток | BMC Microbiology
1.
Matsushita M, Fujikawa H: Ограниченный диффузией рост при образовании бактериальных колоний. Physica A. 1990, 168: 498-506. 10.1016 / 0378-4371 (90) -Е.
Артикул CAS Google Scholar
2.
Budrene EO, Berg HC: Сложные паттерны, образованные подвижными клетками Esherichia coli . Природа. 1991, 349: 630-633. 10.1038 / 349630a0.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
3.
Matsuyama T, Kaneda K, Nakagawa Y, Isa K, Hara-Hotta H, Yano I. Новый внеклеточный циклический липопептид, который способствует зависимому от жгутиков и независимому распространяющемуся росту Serratia marcescens . J Bacteriol. 1992, 174: 1769-1776.
PubMed Central CAS PubMed Google Scholar
4.
Бен-Джейкоб Э., Шмуэли Х., Шочет О., Тененбаум А: Адаптивная самоорганизация во время роста бактериальных колоний.Physica A. 1992, 187: 378-424. 10.1016 / 0378-4371 (92)
-8.
Артикул Google Scholar
5.
Мацуяма Т., Херши Р.М., Мацусита М: Самоподобный морфогенез колоний бактериями как экспериментальная модель фрактального роста клеточной популяции. Фракталы. 1993, 1: 302-311. 10.1142 / S0218348X93000320.
Артикул Google Scholar
6.
Бен-Джейкоб Э., Тененбаум А., Шочет О., Авидан О: Голотрансформации бактериальных колоний и кибернетика генома.Physica A. 1994, 202: 1-47. 10.1016 / 0378-4371 (94)
-1.
Артикул Google Scholar
7.
Holt JG, (Ed): Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 1994, Балтимор: Уильямс и Уилкинс, 9
Google Scholar
8.
Бен-Джейкоб Э., Шочет О., Коэн И., Тененбаум А., Цирок А., Вичек Т.: Регулирование и контроль коммуникации во время сложного формирования паттерна бактериальных колоний.Фракталы. 1994, 2: 15-44. 10.1142 / S0218348X9400003X.
Артикул Google Scholar
9.
Бен-Джейкоб Э., Шохет О., Тененбаум А., Коэн И., Цирок К., Вичек Т.: Общее моделирование моделей кооперативного роста в бактериальных колониях. Природа. 1994, 368: 46-49. 10.1038 / 368046a0.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
10.
Blat Y, Eisenbach M: Tar-зависимое и независимое формирование паттерна Salmonella typhimurium .J Bacteriol. 1995, 177: 1683-1691.
PubMed Central CAS PubMed Google Scholar
11.
Будрене Э.О., Берг Х.С.: Динамика образования симметричных узоров хемотаксическими бактериями. Природа. 1995, 376: 49-53. 10.1038 / 376049a0.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
12.
Бен-Джейкоб Э., Коэн И., Шочет О., Арансон И., Левин Х., Цимринг Л.: Сложные бактериальные колонии.Природа. 1995, 373: 566-567. 10.1038 / 373566a0.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
13.
Дворкин М: Последние достижения в социальной биологии и биологии развития миксобактерий. Microbiol Rev.1996, 60: 70-102.
PubMed Central CAS PubMed Google Scholar
14.
Бен-Джейкоб Э., Коэн И., Цирок А., Вичек Т., Гутник Д.Л.: Хемомодуляция клеточного движения: коллективное образование вихрей путем роения бактерий и колониального развития.Physica A. 1997, 238: 181-197. 10.1016 / S0378-4371 (96) 00457-8.
Артикул Google Scholar
15.
Шапиро Дж .: Представление о бактериальных популяциях как о многоклеточных организмах. Ann Rev Microbiol. 1998, 52: 81-104. 10.1146 / annurev.micro.52.1.81.
Артикул CAS Google Scholar
16.
Бен-Якоб Э., Коэн И., Гутник Д.Л.: Кооперативная организация бактериальных колоний: от генотипа к морфотипу.Ann Rev Microbiol. 1998, 52: 779-806. 10.1146 / annurev.micro.52.1.779.
Артикул CAS Google Scholar
17.
Мацусита М., Вакита Дж., Ито Х., Рафолс И., Мацуяма Т., Сакагути Х., Мимура М.: Рост границы раздела и формирование паттерна в бактериальных колониях. Physica A. 1998, 249: 517-524. 10.1016 / S0378-4371 (97) 00511-6.
Артикул Google Scholar
18.
Розенберг Э. (Эд): Микробная экология и инфекционные болезни.1999, Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press
19.
Ди Франко С., Беккари Э., Сантини Т., Писнески Г., Текче Г.: Форма колонии как генетический признак в образующем паттерн Bacillus mycoides . BMC Microbiol. 2002, 2: 33-10.1186 / 1471-2180-2-33.
PubMed Central Статья PubMed Google Scholar
20.
Kuner JM, Kaiser D: Морфогенез плодовых тел в погруженных культурах Myxococcus xanthus .J Bacteriol. 1982, 151: 458-461.
PubMed Central CAS PubMed Google Scholar
21.
Мацутама Т., Мацусита М.: Морфогенез самоподобных колоний с помощью грамотрицательных палочек как экспериментальная модель фрактального роста клеточной популяции. Микробиология. 1992, 58: 1227-1232.
Google Scholar
22.
Ohgiwari M, Mitsuge M, Tohey M: Морфологические изменения в росте структуры бактериальных колоний.J Phys Soc Jpn. 1992, 61: 816-822. 10.1143 / JPSJ.61.816.
Артикул Google Scholar
23.
Salmond GPC, Bycroft BW, Stewart GSAB, Williams P: Бактериальная загадка: взлом кода межклеточной коммуникации. Mol Microbiol. 1995, 16: 615-624. 10.1111 / j.1365-2958.1995.tb02424.x.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
24.
Вирт Р., Мушолл А., Ваннер Дж .: Роль феромонов в бактериальных взаимодействиях.Trends Microbiol. 1996, 4: 96-103. 10.1016 / 0966-842X (96) 81525-3.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
25.
Коэн И., Цирок А., Бен-Джейкоб Э. Адаптивная самоорганизация, основанная на хемотактике, во время колониального развития. Physica A. 1996, 33: 678-698. 10.1016 / S0378-4371 (96) 00247-6.
Артикул Google Scholar
26.
Czirok A, Ben-Jacob E, Cohen II, Vicsek T: Формирование сложных бактериальных колоний посредством самогенерируемых вихрей.Phys Rev E. 1996, 54: 1791-1801. 10.1103 / PhysRevE.54.1791.
Артикул CAS Google Scholar
27.
Velicer GJ, Kroos L, Lenski RE: Утрата социального поведения Myxococcus xanthus во время эволюции в неструктурированной среде обитания. Proc Natl Acad Sci USA. 1998, 95: 12376-12380. 10.1073 / pnas.95.21.12376.
PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar
28.
Козловский Ю., Коэн И., Голдинг И., Бен-Джейкоб Е. Модель смазывающих бактерий для разветвленного роста бактериальных колоний. Phys Rev E. 1999, 59: 7025-7035. 10.1103 / PhysRevE.59.7025.
Артикул CAS Google Scholar
29.
Shimkets LJ: Межклеточная передача сигналов во время развития плодовых тел Myxococcus xanthus . Annu Rev Microbiol. 1999, 53: 525-549. 10.1146 / annurev.micro.53.1.525.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
30.
Бен Джейкоб Э, Коэн И., Левин Х: Кооперативная самоорганизация микроорганизмов. Adv Phys. 2000, 49: 395-554. 10.1080 / 000187300405228.
Артикул CAS Google Scholar
31.
Strassmann JE: Бактериальные мошенники. Природа. 2000, 404: 555-556. 10.1038 / 35007175.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
32.
Велисер Г.Дж., Кроос Л., Ленски Р.Э .: Изменения в развитии социальной бактерии Myxococcus xanthus .Природа. 2000, 404: 598-601. 10.1038 / 35007066.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
33.
Бен-Джейкоб Э., Левин Х .: Артистизм природы. Природа. 2001, 409: 985-986. 10.1038 / 35059178.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
34.
Crespi BJ: Эволюция социального поведения у микроорганизмов. Trends Ecol Evol. 2001, 16: 178-183.10.1016 / S0169-5347 (01) 02115-2.
Артикул PubMed Google Scholar
35.
Голдинг И., Гутник Д.Л., Черпаков М., Хелбинг Д., Рон И.Г .: Кооперативная организация бактерий в условиях антибиотического стресса. Physica A. 2002, 282: 247-282.
Google Scholar
36.
Басслер Б.Л .: Светская беседа: межклеточная коммуникация у бактерий. Клетка. 2002, 109: 421-424. 10.1016 / S0092-8674 (02) 00749-3.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
37.
Миллер МБ: Параллельные системы контроля кворума сходятся, чтобы регулировать вирулентность в Vibrio cholerae . Клетка. 2002, 110: 303-314. 10.1016 / S0092-8674 (02) 00829-2.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
38.
Коленбрандер П.Е., Андерсен Р.Н., Блехерт Д.С., Эгланд П.Г., Фостер Дж.С., Палмер Р.: Связь между бактериями полости рта.Microbiol Mol Biol Rev.2002, 66: 486-505. 10.1128 / MMBR.66.3.486-505.2002.
PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar
39.
Бен-Джейкоб Э: Бактериальная самоорганизация: совместное усиление комплексности и приспособляемости в динамической среде. Philos Trans R Soc Lond A. 2003, 361: 1283-1312. 10.1098 / rsta.2003.1199.
Артикул Google Scholar
40.
Ксавье КБ, Басслер BL: Определение кворума LuxS: больше, чем просто игра с числами. Curr Opin Microbiol. 2003, 6: 191-197. 10.1016 / S1369-5274 (03) 00028-6.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
41.
Mok KC, Wingreen NS, Bassler BL: Vibrio harveyi quorum sensing: детектор совпадений для двух аутоиндукторов контролирует экспрессию генов. EMBO J. 2003, 22: 870-881. 10.1093 / emboj / cdg085.
PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar
42.
Velicer GJ: Социальная рознь в микробном мире. Trends Microbiol. 2003, 7: 330-337. 10.1016 / S0966-842X (03) 00152-5.
Артикул Google Scholar
43.
Комото А., Ханаки К., Маэносоно С., Вакано Д. Ю., Ямагути Ю., Имамото К. Динамика роста колонии Bacillus circus . J Theor Biol. 2003, 225: 91-97. 10.1016 / S0022-5193 (03) 00224-8.
Артикул PubMed Google Scholar
44.
Харши Р.М.: Подвижность бактерий на поверхностях: много путей к общей цели. Annu Rev Microbiol. 2003, 57: 249-273. 10.1146 / annurev.micro.57.030502.0
.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
45.
Левин Х., Бен Джейкоб Э: Физические схемы, лежащие в основе формирования биологического рисунка — примеры, проблемы и стратегии. J Физическая биология. 2004, 1: 14-22. 10.1088 / 1478-3967 / 1/2 / P01.
Артикул Google Scholar
46.
Бен Джейкоб E, Беккер I, Шапера Y, Левин H: Бактериальная лингвистическая коммуникация и социальный интеллект. Trends Microbiol. 2004, 12: 366-372. 10.1016 / j.tim.2004.06.006.
Артикул PubMed Google Scholar
47.
Бен Джейкоб Э., Ааронов Ю., Шапира Ю. Сложность использования бактерий. Биопленки. 2005, 1: 239-263. 10.1017 / S14705001596.
Артикул Google Scholar
48.
Бен Джейкоб Э, Левин Х: Самоинженерные возможности бактерий. Интерфейс J Roy Soc. 2006, 3: 197-214. 10.1098 / rsif.2005.0089.
Артикул CAS Google Scholar
49.
Голдинг И., Коэн И., Бен Джейкоб Е: Исследования формирования секторов в расширяющихся бактериальных колониях. Письма еврофизики. 1999, 48: 587-593. 10.1209 / epl / i1999-00524-7.
Артикул CAS Google Scholar
50.
Рон И., Голдинг И., Лифсиц-Мерсер Б., Бен-Якоб Е.: Всплески секторов в расширяющихся бактериальных колониях как возможная модель роста опухоли и метастазов. Physica A. 2003, 320: 485-496. 10.1016 / S0378-4371 (02) 01547-9.
Артикул Google Scholar
51.
Скорее PN: Дифференцировка клеток Swarmer в Proteus mirabilis . Appl Environ Microbiol. 2005, 7: 1065-1073. 10.1111 / j.1462-2920.2005.00806.x.
CAS Google Scholar
52.
Thar R, Kühl M: Формирование сложного паттерна морских градиентных бактерий, объясненное простой компьютерной моделью. FEMS Microbiol Lett. 2005, 246: 75-79. 10.1016 / j.femsle.2005.03.036.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
53.
Кирнс Д.Б., Лосик Р.: Подвижность роения у не одомашненных Bacillus subtilis . Mol Microbiol. 2003, 49: 581-590. 10.1046 / j.1365-2958.2003.03584.x.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
54.
Кернс Д.Б., Чу Ф., Руднер Р., Лосик Р.: Гены, управляющие роением в Bacillus subtilis , и доказательства механизма изменения фазы, контролирующего подвижность поверхности. Mol Microbiol. 2004, 52: 357-369. 10.1111 / j.1365-2958.2004.03996.x.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
55.
Мендельсон Н., Моралес Д., Туэйтс Дж. Дж.: Механизмы, ответственные за формирование двумерного рисунка в популяциях бактериальных макроволокон, выращенных на твердых поверхностях: соединение волокон и создание запретных зон.BMC Microbiol. 2002, 2:
Google Scholar
56.
Коэн И., Рон И.Г., Бен Джейкоб Э.: От ветвления до формирования паттерна туманности во время колониального развития бактерий Paenibacillus alvi . Physica A. 2000, 286: 321-336. 10.1016 / S0378-4371 (00) 00335-6.
Артикул Google Scholar
57.
Черпаков М, Бен Джейкоб Э, Гутник ЛД: Paenibacillus dendritiformis sp.nov., предложение о новом образцеобразующем виде и его локализации в филогенетическом кластере. Int J Syst Bacteriol. 1999, 49: 239-246.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
58.
Бен-Якоб Э., Коэн I, Цирок А: Умные бактериальные колонии. Физика биологических систем: от молекул до видов. Под редакцией: Flyrbjerg H, Hertz S, Jensen MH, Mouristen OG, Snepper K. 1997, Берлин: Springer, 307-324.
Глава Google Scholar
59.
Бен-Джейкоб Э: От снежинки к росту колоний бактерий. II. Кооперативное формирование сложных колониальных моделей. Contemp Phys. 1997, 38: 205-241. 10.1080 / 001075197182405.
Артикул CAS Google Scholar
60.
Киров С.М., Тасселл BC, Семмлер А.Б., О’Донован Л.А., Рабаан А.А., Шоу Дж.Г.: Боковые жгутики и роящаяся подвижность у видов Aeromonas . J Bacteriol. 2002, 184: 547-555. 10.1128 / JB.184.2.547-555.2002.
PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar
61.
Джонс Б.В., Янг Р., Махентиралингам Э., Стиклер Д.Д.: Ультраструктура рафтов Proteus mirabilis роевых клеток и роль роения в катетер-ассоциированной инфекции мочевыводящих путей. Infect Immun. 2004, 72: 3941-3950. 10.1128 / IAI.72.7.3941-3950.2004.
PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar
62.
Ingham CJ, Furneaux PA: Мутации в бета-субъединице РНК-полимеразы Bacillus subtilis , которые придают устойчивость к рифампицину и гиперчувствительность к NusG. Микробиология. 2000, 146: 3041-3049.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
63.
Liaw SJ, Lai HC, Ho SW, Luh KT, Wang WB: Ингибирование экспрессии фактора вирулентности и дифференцировки роения у Proteus mirabilis с помощью п-нитрофенилглицерина.J Med Microbiol. 2000, 49: 725-731.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
64.
Friedberg EC, Walker GC, Siede W: SOS-ответы и толерантность к повреждению ДНК у прокариот. Ремонт ДНК и мутагенез. 1995, Вашингтон, округ Колумбия: Американское общество микробиологии, 407-464.
Google Scholar
65.
Au N, Kuester-Schoeck E, Mandava V, Bothwell LE, Canny SP, Chachu K, Colavito SA, Fuller SN, Groban ES, Hensley LA, O’Brien Theresa, Amish Shah, Jessica T, Tierney , Томм Луиза, О’Гара Томас, Горанов А.И.: Генетический состав системы SOS Bacillus subtilis .J Bacteriol. 2005, 187: 7655-7666. 10.1128 / JB.187.22.7655-7666.2005.
PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar
66.
Секвенирование выполнено по 454 технологиям. Предварительные результаты с использованием TIGR-аннотации контигов, идентифицированных путем секвенирования, показывают, что геном включает около 6800 открытых рамок считывания (ORF). Результаты также указывают на существование генов, связанных с синтезом сурфактина, а также на существование 42 генов, связанных с жгутиками, и нескольких ключевых генов, связанных с хемотаксисом, включая CheA, CheC, CheD и CheW, которые организованы в 6 оперонов.Что касается SOS-ответа, мы определили гомологию с несколькими ключевыми SOS-генами, такими как RecA, LexA, DinB, UvrA и Uvr B. Усилия по секвенированию проводятся в рамках инициативы Таубера в Тель-Авивском университете в сотрудничестве с группой GeneBee в МГУ. , Центр генома в Институте науки Вейцмана и DYN-GS Israel, E. Ben Jacob (неопубликовано).
67.
Арнольд Дж. У., Шимкетс Л. Дж .: Ингибирование межклеточных взаимодействий в Myxococcus xanthus с помощью Congo Red.J Bacteriol. 1988, 170: 5765-5770.
PubMed Central CAS PubMed Google Scholar
68.
Кинзингер Р.Ф., Кернс Д.Б., Хейл М., Фолл Р.: Генетические требования для зависимого от ионов калия распространения колонии в Bacillus subtilis . J Bacteriol. 2005, 187 (24): 8462-8469. 10.1128 / JB.187.24.8462-8469.2005.
PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar
69.
Jha A: Слизистая плесень, использованная для создания первого робота, управляемого живыми клетками. [http://www.guardian.co.uk/science/story/0,,1709944,00.html]
70.
Rasband WS: ImageJ. Национальные институты здоровья, Бетесда, Мэриленд, США. 2004 г., [http://rsb.info.nih.gov/ij/]
Google Scholar
71.
Ingham CJ, van den Ende M, Wever PC, Schneeberger PM: Экспресс-тестирование чувствительности к антибиотикам и триметоприм-опосредованная филаментация клинических изолятов Enterobacteriaceae на новой пористой культуральной подложке.J Med Microbiol. 2006, 55: 1511-1519. 10.1099 / jmm.0.46585-0.
Артикул CAS PubMed Google Scholar
72.
Daniels R, Reynaert S, Hoekstra H, Verreth C, Janssens J, Braeken K, Fauvart M, Beullens S, Heusdens C, Lambrichts I, de Vos DE, Vanderleyden J, Vermant J, Michiels J: Quorum сигнальные молекулы как биосурфактанты, влияющие на роение в Rhizobium etli . Proc Natl Acad Sci. 2002, 103: 14965-14970. 10.1073 / pnas.0511037103.
Артикул Google Scholar
73.
Хеймбрук М.Э., Ван В.Л., Кэмпбелл Г.: Легкое окрашивание жгутиков бактерий. J Clin Microbiol. 1989, 11: 2612-2615.
Google Scholar
Micro-Electro-Fluidic Probe (MeFP) для выделения и формирования образца клеток — ScienceDaily
Команда исследователей из NYU Abu Dhabi разработала MicroelectroFluidic Probe (MeFP) с функцией диэлектрофореза (DEP), которая может последовательно разделять и образец клеток млекопитающих в открытой микрофлюидной системе.Клетки млекопитающих крошечные (примерно одна десятая диаметра одной пряди волоса), и поэтому становится очень сложно избирательно обогащать и структурировать клетки при разрешении отдельных клеток. Разработанный инструмент способен выборочно обогащать представляющие интерес клетки с помощью магнитоподобной остановки, которая приводит к захвату целевых клеток из потока жидкости, оставляя нецелевые клетки в потоке нетронутыми. Следовательно, задержанные клетки высвобождаются и рисуются на подложке в процессе, подобном 2D-печати.
Исследование продемонстрировало MeFP с эффективностью изоляции до 100%, чистотой разделения 90% и скоростью осаждения образца в несколько секунд. Использование этого метода для сортировки, очистки и сборки клеток в контролируемые образцы является первым шагом в процессе тканевой инженерии.
Устройство также имеет потенциальное применение для последовательного сбора и определения характеристик циркулирующих опухолевых клеток (злокачественных клеток, обнаруживаемых в крови больных раком). Поскольку MeFP может непосредственно откладывать захваченные клетки на любой нижней плоской подложке, эти клетки могут быть впоследствии протестированы с несколькими химиотерапевтическими препаратами, используя только микрофлюидную функцию того же устройства.
В статье «Микрожидкостный зонд для последовательного разделения клеток и формирования паттерна», опубликованной в журнале Lab on the Chip , исследователи представляют процесс создания инструмента, который может разделять и формировать ячейки с помощью сил DEP в открытом канале. -без «микрофлюидная система», позволяющая расти клеточным образцам со сложной тканеподобной структурой. MeFP — это микрофлюидный зонд с отверстиями для впрыска и аспирации, интегрированный с набором электродов с микрогорбом на конце.Регулируя конфигурацию потока MeFP, исследователи смогли структурировать культуру клеток, содержащую два разных типа клеток, для исследований гомотипического и гетеротипического взаимодействия клеток.
С помощью MeFP можно последовательно сортировать биологические клетки различных типов и одновременно формировать их узор на любом плоском субстрате, чтобы сформировать требуемый паттерн клеток и, возможно, тканевые конструкции. Примеры различных типов клеток включают раковые клетки, стволовые клетки, иммунные клетки и эритроциты, и это лишь некоторые из них.
«MeFP — это многофункциональный инструмент для манипулирования клетками в открытом бесканальном пространстве», — сказал ведущий исследователь и доцент кафедры механической и биомедицинской инженерии в NYUAD Мохаммад Касайме. «Эта демонстрация его простой, динамичной и настраиваемой природы вдохновит на создание новых клеток. паттернирование, тканевая инженерия и приложения в биологических науках «.
«Разработанный инструмент может использоваться для сканирования любой плоской подложки и может разделять определенные ячейки на основе их электронных подписей», — прокомментировал первый автор и научный сотрудник Global PhD в области машиностроения в NYUAD Ayoola T.Бриммо.
«Это первое исследование, объединяющее силы DEP в открытом микрофлюидном зонде, обладающем характеристиками гидродинамических ограничений и возможностями сканирования», — сказал второй автор и старший научный сотрудник в области механической и биомедицинской инженерии в NYUAD Anoop Menachery.
История Источник:
Материалы предоставлены Нью-Йоркским университетом . Примечание. Содержимое можно редактировать по стилю и длине.
.