Кролівництво розведення кролів клітки: Розведення кролів в домашніх умовах, клітках, вольєрах для початківців як бізнес

вибір і особливості утримання кролів, будівництво клітини, відео

Домашнє кролівництво серед всіх видів розвитку домашніх тварин дуже популярно у всьому світі. Пояснюється це невеликими витратами на утримання кроликів і швидким їх розведенням. Успіх будь-якого кролівникові буде забезпечений, якщо годувати тварин хорошими кормами, забезпечити їм відповідні умови утримання і дотримуватися санітарно-гігієнічні норми. В результаті кролівник отримає смачне дієтичне м`ясо і фінансовий прибуток.

вибір породи

З усіх видів кроликів найбільшу цінність представляють близько 20 порід, які поділяються на три категорії:

• м`ясна порода, від якої можна отримати найбільшу кількість м`яса;
• пухові або шкурковие породи;
• м`ясо-шкурні породи.

Плануючи розводити кроликів в домашніх умовах, спочатку потрібно визначити перспективну нішу збуту, щоб зрозуміти яку породу вибрати для розведення.

Молодняк для розведення продається на фермах. Щоб вибрати здорових кроликів, потрібно звернути увагу на їх зовнішній вигляд. У тварин повинні бути:

• чисті очі;
• блискучий щільний ворс;
• міцне тулуб;
• вгодованість і хороша активність.

Забарвлення шкірки, довжина і вага повинні відповідати обраній породі. Не рекомендується купувати кроликів з наступними недоліками:

• ознаками ожиріння або виснаження;
• випадає або скуйовдженим ворсом;
• провисла спина або животом;
• звислими кінчиками вух;
• виступаючими стегнами;
• витягнутою головою;
• кривими лапами.

Якщо перший час тварини будуть жити в будівництві без підігріву, потрібно брати ту породу, яка підходить для кліматичних умов вашого регіону.

Вибір клітки для утримання кролів

При розведенні кроликів в домашніх умовах необхідно подбати про облаштування їхнього житла. При відкритому утриманні тварин на вулиці, для них готуються вольєри, ями або клітини. При закритому утриманні — крільчатника. Способи змісту можна комбінувати, і виносити клітини на відкрите повітря в теплу пору року.

Молоді і статевозрілі тварини утримуються в окремих крільчатниках, оскільки у тримісячних особин починає зростати агресивність.

Клітини бувають різних видів:

1. односекційні.
2. Двосекційні, в яких додатково встановлені гніздові і кормові відсіки.
3. одноярусні.
4. багатоярусні.

Крільчатник можна купити в зоомагазині або зробити своїми руками.

Поради з будівництва клітини для кроликів

Досвідчені фермери рекомендують робити стіни і дах крільчатника з металевої сітки, а підлога з дерев`яної рейки. Щоб було зручно підтримувати чистоту в клітках, при будівництві статі між рейками залишають відстань в один сантиметр.

Можна виконати крільчатник повністю з металевої сітки. Такі конструкції мають деякі переваги:

• простота в обслуговуванні;
• компактність;
• легкість.

Однак що містяться в такому крільчатнику тварини часто страждають від продерматіта лап.

Єдиного стандарту розмірів клітин не існує. Мінімальні габарити крільчатника повинні бути 150х70х70 см. Розмір клітини повинен бути таким, щоб тваринам в ній не було тісно, ​​і вони могли вільно пересуватися. Окремий крільчатник потрібно для 3-4 кролиць і маленьких кроленят, які спочатку будуть міститися з матерями. Через деякий час кроленят переселяють в іншу клітку, а кролиця готується до наступного окролу.

Передня стінка житла повинна бути трохи більше задньої. Для того щоб було зручно доглядати за кроликами, слід зробити кришку панелі. Крільчатник потрібно розділити на секції, поставивши між ними перегородку з лазом для тварин.

Особливу увагу потрібно приділити поїлки, які повинні зручно розташовуватися і бути завжди наповнені чистою водою. Поїлки і годівниці можна зробити підвісними, висувними або стаціонарними. Якщо вони будуть стаціонарно розташовуватися всередині клітини, то їх слід обладнати кришками.

Крільчатника, які будуть розташовуватися в домашніх умовах, краще всього виконувати в вигляді будиночка. На відкритому повітрі клітина встановлюється на опори для того, щоб до кроликам не могли проникнути гризуни, та й доглядати за тваринами буде зручно.

Особливості утримання кролів

Кролівництво в домашніх умовах передбачає поступове збільшення поголів`я кроликів, для чого тварин необхідно забезпечити житлом, якісним кормом і дотриманням санітарно-гігієнічних правил.

годування кроликів

Харчування тварин повинно бути регулярним. У клітці постійно повинна бути вода і сіно. За добу кролики випивають кількість води, яке в кілька разів перевершує обсяг з`їденої їжі.

Як корм використовуються:

• коренеплоди у вигляді брукви, буряка, картоплі;
• сіно;
• трава;
• листя білокачанної капусти;
• свіжі овочеві відходи з кухні;
• висівки;
• зерно бобових і злакових;
• гранульований комбікорм, який повинен бути збагачений протеїном і на 40% складатися з трав`яного борошна;
• макуха;
• м`ясо-кісткове або рибне борошно.

Крім цього, раціон слід поповнювати легкозасвоюваними добавками у вигляді кухонної солі, каротину, фосфору, кальцію, протеїну.

За рік одна кролиця може з`їсти:

• близько 120 кг коренеплодів;
• більше 300 кг концентрованих кормів;
• близько 100 кг сіна;
• приблизно 400 кг зеленої трави.

Влітку кролики можуть харчуватися усім, що росте на городі. У їх раціон обов`язково потрібно додавати пшеницю, овес або ячмінь і різні фрукти.

особливості догляду

Підтримка тварин в здоровому стані безпосередньо залежить від дотримання деяких правил щодо їх догляду:

1. Підопічним потрібно забезпечити свіже повітря.
2. Кроликів можна тримати на протязі.
3. Кожні десять днів перебуває в клітинах обладнання слід дезінфікувати.
4. Крільчатника, поїлки та годівниці слід чистити щодня.
5. Тварин регулярно рекомендується оглядати. Хворого підопічного ізолюють і викликають ветеринара.

Щоб уникнути небезпечних для кроликів захворювань, тваринам потрібно вчасно зробити щеплення. Для цього в аптеці можна придбати моновакцину або асоційовану вакцину. Щеплення повинен робити ветеринарний лікар або досвідчений фермер.

розмноження кролів

При правильному плануванні случек потомство від цих тварин можна отримувати весь рік. Оптимальний вік розмноження — 7 місяців у самців і 5 місяців у самки. Занадто молода самка може не доносити потомство, а від недостиглого самця часто народжуються слабкі, а іноді і нежиттєздатні кроленята.

Щоб потомство народжувалося здоровим, виробників потрібно ретельно вибирати. Якщо у кролів в 30% випадків зусилля щодо продовження роду не увінчалися успіхом, він відбраковують.

кролиця відбраковують в наступних випадках:

• якщо вона не змогла завагітніти після двох або трьох случек;
• з`їла своїх дитинчат;
• в двох приплоду поспіль виносила менше 5 кроленят.

Виробники обов`язково повинні мати нормальну вагу. У ожіревшіх тварин статева охота може не настати зовсім, а від занадто худих народжується хворобливе потомство. Хворі кроленята народяться і в тому випадку, якщо його батьки будуть з одного посліду.

Злучка проводиться під час полювання у самок. Взимку вона буває кожні 7-9 днів, а влітку кожні 5-6 доби. Триває полювання протягом трьох — п`яти днів.

При плануванні случек проводиться розрахунок потрібної кількості виробників. Молодий кро покриває самку 1-2 рази на день, а дорослий — до 4 самок за добу. Час від часу самцям потрібно давати перепочити. Щоб якості виробника не погіршились, на одного самця повинно припадати від 8 до 12 самок.

Як проводити злучку?

Злучка повинна проходити в клітці, де міститься кро, в іншому випадку самець буде відчувати себе не дуже впевнено. Оскільки кролики є дуже активними тваринами, з клітки попередньо забираються всі предмети, в тому числі годівниці і поїлки. В оселі не повинно бути ніяких гострих предметів у вигляді стирчить дроту або цвяхів, про які тварини можуть легко поранитися. Через два тижні кролицю до самця підсаджують ще раз для контрольної злучки.

Вагітна самка починає бігати по клітці і агресивно вести себе по відношенню до кавалера. вагітність можна визначити за допомогою пальпації. Для цього у кролиці обмацують живіт. Ближче до крижів він повинен бути щільним. Можна намацати завбільшки з горох плоди, які розташовуються ланцюжком.

Вагітність самки триває від 29 до 33 днів. Перед пологами вона почне стягувати в кут клітки сухе сіно, видирати з грудей пух і вистилати їм підлогу житла. Таким чином кролиці в`ють гніздо. В цей час в клітці у кролиці повинно бути дві поїлки зі свіжою водою. Інакше під час окролу через нестачу рідини в організмі вона може загризти кроленят.

Пологи у кроликів проходять досить швидко. Розродитися самка може протягом 20-30 хвилин. Народжених голенькими і сліпими кроленят самка загортає в свій пух.

Кролівництво в домашніх умовах можна вважати успішним, якщо після вирахування з дохідної суми всіх витрат ви залишилися в плюсі. Це означає, що ви правильно налагодили весь процес утримання та розведення кроликів.

Споделете в социалните мрежи:

Кролики у власному домогосподарстві, утримання, догляд та вирощування

08.08.2019

«Кролики — це не тільки цінне хутро, а й три, чотири кілограми дієтичного, легкозасвоюваного м’яса …»

. Хто з нас не пам’ятає цю давню смішну сценку, котра вперше вийшла на екрани в програмі «Фітіль» в далекому 1984 році, а згодом була багаторазово інтерпретована відомими коміками.

Кінцевим продуктом цих довговухих пухнастих звірят може бути не тільки смачне та корисне м’ясо, а й цінна шкурка, кролячий пух. Водночас утримання і догляд за цими милими тваринами не вимагають великих фінансових витрат та багато часу. 

У світі існує понад двісті (!) Різновидів кролів, які можна розділити на три групи:

·     М’ясні породи

·      М’ясо-хутряні породи

·      Хутряні (пухові) породи

Купуючи кроликів для вирощування у власному господарстві, перевагу слід надати м’ясній породі, оскільки вона забезпечить достатню кількість м’яса, та й догляд за такими кролями здійснювати набагато простіше, бо вони менш вибагливі й відрізняються спокійним і доброзичливим характером.

Якщо розведення кроликів ви розпочинаєте вперше, то немає потреби зупиняти свій вибір на рідкісних й екзотичних породах, оскільки економічно більш обґрунтованим буде вибір найбільш продуктивних місцевих порід кролів.

Розрізняють три моделі утримання кроликів:

·   Закритий спосіб утримання, при якому кролики вигодовуються в приміщенні (крольчатнику).

· Відкритий спосіб, коли тваринки утримуються на вулиці у клітках, ямах чи загороджених волєрах, оскільки завдяки своєму теплому хутру взимку кролі здатні витримувати морози до мінус двадцати градусів.

·   Комбінований спосіб, при котрому в теплу пору року кролики живуть на відкритому повітрі, а з настанням холодів переселяються у приміщення.

Кролики надзвичайно плідні тварини, а їх м’ясо коштує в два рази дорожче за свинину. Якби не вірусні хвороби, що не так давно прийшли до нас з-за океану, проблем з їх вирощуванням не було б зовсім.

Утримання й догляд за кролями

Наші прадіди вирощували кроликів за примітивною моделлю: виривали в городі велику глибоку яму, де кролики мешкали у викопаних самостійно норах і плодилися «самі по собі». Господарі годували тварин сіном і час від часу відловлювали їх на забій.

У наш час більш розповсюджене утримання кроликів у клітках.

Клітка для кроликів має бути чистою, світлою та сухою. Необхідно пам’ятати про те, що кролики погано сприймають протяги та підвищену вологість повітря.

Для виготовлення клітки застосовують, як правило, металеву сітку, дерев’яні дошки, клеєну фанеру та брус. Можна, звичайно, придбати готові клітки, але дорослому чоловікові за наявності необхідних матеріалів неважко  зробити їх самостійно.

Молодих і дорослих кролів необхідно тримати окремо, тому відпочатку знадобиться одразу кілька кліток. Підростаючий молодняк (до тримісячного віку) може жити групками по кілька штук, але після того, як поведінка особин стане ворожою і агресивною по відношенню один до одного, кроликів необхідно буде розселити.

Самку, що має незабаром привести кроленят, також слід поселити в окрему клітку, з чітким розумінням того, що в ній і мати, і малята проведуть разом перший місяць життя.

Декілька порад з благоустрою кліток

Якщо клітку з тваринами планується використовувати на відкритому повітрі, її бажано утеплити (стелю, стіни і підлогу). У сильні морози кролики будуть вам за це вдячні.

Металеву сітку для настилу підлоги краще не використовувати, а змайструвати підлогу з набірних дерев’яних дощечок, бо в іншому разі кролі можуть захворіти продерматитом (запаленням лапок).

Щілина між дошками підлоги повинна становити приблизно один, півтора сантиметра. Така відстань буде достатньою, щоб дозволити легко вичищати відходи життєдіяльності тварин. Підлогу в клітці можна зробити і подвійною, щоб нижня частина слугувала піддоном. Це значно спростить та полегшить процес прибирання.

При облаштуванні кліток необхідно особливу увагу приділити поїлкам і годівницям. Вони повинні бути добре закріплені і при цьому доступні для очищення, яке бажано проводити щодня.

Годівниці мають бути пристосовані для годування кролів коренеплодами, свіжою травою і сіном.

Здоров’я вихованців

Як вже зазначалося раніше, кролики потребують попередньої вакцинації проти небезпечних хвороб та інфекцій, тому щеплення від міксоматозу та геморагічної хвороби (ВГБК), що погано піддаються лікуванню, є обов’язковими. Вакцину бажано купувати у спеціалізованих ветеринарних аптеках, а щеплення можна зробити і в домашніх умовах. Для вакцинації краще придбати комплексний препарат (від міксоматозу і ВГБК в одній ампулі). Перша вакцинація проводиться у віці чотирьох-шести тижнів, а потім її слід повторювати через кожні шість місяців.

Щоб зберегти здоров’я поголів’я, бажано регулярно проводити огляд усіх тварин з метою завчасного виявлення хвороб і один раз в десять днів здійснювати обов’язкову профілактичну дезінфекцію усіх кліток.

У разі виявлення знесилених чи хворих особин, їх необхідно терміново ізолювати й викликати спеціаліста – ветеринара для отримання консультації та належного лікування.

Харчування кроликів

Раціон харчування у кроликів досить багатий. Вони вживають практично усе, що росте в саду і на городі. Кормом слугують овочі, фрукти, коренеплоди, свіжа зелень (конюшина, люцерна, кульбаба та інші трави) і комбінований корм. Ласощами для кролів є злакові культури (пшениця, овес, ячмінь). У зимовий час тварин підгодовують запашним сіном. 

Протягом року одна доросла самка (з кроленятами) вживає:

·         Понад чотириста кілограм зеленої маси;

·         Більш як сто кілограм сіна;

·         Понад триста кілограм комбікорму;

·         Більше ста килограм картоплі та інших овочів і коренеплодів

Не слід також забувати про чисту і свіжу воду в поїлках, оскільки дорослий кріль за день випиває набагато більше води (в кілька разів), ніж вживає їжі.

Розмноження кроликів

До проведення парування бажано гарненько оглянути тварин з метою виявлення хвороб і допускати до злучки тільки міцних і здорових особин. Здорові кролики відрізняються повнотілістю й активною поведінкою.

Для отримання потомства самку (бажано шестимісячну) підсаджують до самця, а не навпаки, оскільки чоловіча особина набагато гірше адаптується до нових умов і довго звикає до чужої клітки, тобто даремно витрачає свої сили.

Щоб не заважати процесу парування, з клітки необхідно прибрати все зайве.

Після завершення акту самець видає переможний крик і падає набік. Незабаром відбувається повторне парування (пубертатний кріль здатний покрити до чотирьох, п’яти самок в день).

Для отримання гарантованого результату бажано через тиждень процес парування повторити. Запліднена самка починає проявляти до самця агресію, що є відмінним індикатором стовідсоткової вагітності.

Вагітність самки триває близько місяця і не вимагає участі людини. У виводку, як правило, знаходиться від шести до вісімнадцяти дитинчат (чим їх більше, тим вони дрібніші).

Протягом року молода кролиця може дати до двох виводків, а доросла самка – чотири, п’ять.

Власнику кролів необхідно знати, що видалення у тваринок статевих залоз сприяє швидкому збільшенню їх ваги, а якість м’яса поліпшується, тому, зазвичай за три-чотири місяці до настання статевої зрілості, їх каструють. Дорослих кролів каструють перкутанним способом, перев’язуючи мошонку з насінників і перекриваючи, таким чином, кровопостачання до цих органів.

Хутро чи м’ясо

Власнику кролів необхідно пам’ятати, що для отримання якісної хутряної шкурки слід дочекатися завершення процесу линьки, яка зазвичай відбувається на шостий-восьмий місяць з дня народження тваринок.

Щоб отримати м’ясо, кроликів починають забивати вже з четвертого місяця життя.

Утримання кроликів на присадибній ділянці – це чудова можливість забезпечити сім’ю м’ясом високої якості, а реалізація надлишків дає можливість зміцнити фінансовий добробут, оскільки кролівництво приносить непоганий прибуток.

Запорукою продуктивного розведення кролів є належний догляд та вчасна вакцинація

 Кролівництво – одна з найпоширеніших галузей тваринництва. Смачне, дієтичне м’ясо та хутряна сировина є основними продуктами, які отримуються від цієї галузі. Кролів можна легко розводити як в промислових підприємствах, так і в індивідуальних господарствах населення.

  Кролівництво колись було досить розвинутою галуззю у нашій області. Та сьогодні ним, в основному, займаються кролівники-аматори. Проте серед них і ті, що на досить високий рівень поставили ведення галузі. Вони вміло займаються селекційною роботою із подальшою реалізацією як товарних, так в племінних тварин. Та більшість кролівників, як уже відзначено, є любителями, котрі вирощують кролів в індивідуальних господарствах та на дачних ділянках для власного використання. Кролівництво – дуже вигідна галузь. Короткий період вагітності, висока плодовитість, скороспілість, швидкий ріст і невибагливість до кормів та умов утримання зробили її одною з найпоширеніших тваринництві. За період, відколи кролі були одомашнені, а це близько тисячі років тому, людство вивело близько сотні їх порід для різних напрямків використання. Та за цей період виникло не  менше хвороб кролів (включаючи спільні захворювання), ніж було виведено порід. Тому, утримуючи цих  тварин, слід дбати не лише про належні умови годівлі та догляду, але й про заходи з профілактики та лікування цих хвороб. Досить часто, спілкуючись з  власниками, доводиться чути, що цей рік, мовляв, не є сприятливим і що кролі не ведуться, хворіють та гинуть. Та це все не більше, ніж чутки, які нічим не обґрунтовані. Бо хоч роки і можуть докорінно різнитись  за врожайністю на зерно, травостій, коренеплоди, причини поганого ведення кролів інші. Часто ними є заразні хвороби, які виникаючи можуть звести нанівець всі зусилля і старання власників.

     Найнебезпечнішою і найпоширенішою в останні десятиліття є геморагічна  хвороба кролів, що викликається вірусом, який потрапивши в організм, спричинює незворотні зміни у крові та важке пораження печінки й інших органів. Хвороба, як правило, протікає блискавично і в 70-90% випадків закінчується смертю. Лікування хворих тварин не розроблене, але є вакцина, яка упродовж багатьох років створювала надійний імунітет. Проте люди, які утримували кролів протягом тривалого часу помітили, що в останні роки вакцини «не спрацьовували» і часто навіть провакциновані тварини  хворіли, або й раптово гинули. Річ у тім, що, починаючи із 2010 року, в країнах Західної Європи реєструється атиповий перебіг геморагічної хвороби, викликаний іншим типом збудника (RYDV type 2). Він швидко поширився на всі європейські країни, через що традиційна вакцина не давала належного імунітету.  Та сьогодні вже є вакцина, яка надійно протистоїть вищевказаному типу вірусу і яку можна придбати через систему аптек, котрі функціонують в області. При цьому обов’язково слід  отримувати консультацію про порядок застосування вакцини.

    Другим небезпечним захворюванням вірусної етіології є міксоматоз. Ця хвороба, як і вищезгадана, вже кілька десятиліть вирує на наших теренах, хоч загалом має вже більш, як 100-літню історію. Вірус міксоматозу у свій час широко застосовували в Австралії та Європі для боротьби з дикими кролями, які через надмірну популяцію спустошували поля. Хвороба теж висококонтагіозна, характеризується запаленням очей, слизових оболонок носової порожнини  та підшкірної клітковини в області голови (лев’яча голова), анального отвору. статевих органів та інших ділянок тіла і в більшості випадків закінчується летально. Перебіг хвороби надгострий та хронічний. При хронічному, який може тривати до 2-х тижнів, часто спостегігається поява вузликів в області голови і вух зокрема. При цьому хвороба часто ускладнюється бактеріальною мікрофлорою, що робить ще тяжчим її перебіг. Ефективних методів лікування міксоматозу не розроблено,  а запропоновані методи направлені  лише на боротьбу із вторинною мікрофлорою та на підвищення опірності організму. Проте, для профілактики захворювання є вітчизняні та імпортні вакцини, які створюють тривалий і стійкий імунітет.

  Проте, не раз доводилось чути, що дія вакцин неефективна і кролі все одно гинуть. Варто відзначити, що будь-яка вакцина лише тоді дає результат, коли потрапляє у підготовлений організм, який здатний викликати імунну відповідь,  виробити антитіла і таким чином сформувати імунітет. Та якщо тварини виснажені, потерпають від браку поживних речовин та вітамінів, то досягнути належної напруги імунітету — неможливо. Не виробиться імунітет також в організмі, пораженому гельмінтами та іншими паразитами, тому перед застосуванням вакцин слід переконатись у відсутності у кролів  паразитів, що може засвідчити лабораторне дослідження калу і, за необхідності — провести обробку від гельмінтів. Інколи доводилось чути, що власник провакцинував кролів, а на 2-3 день всі вони загинули. У тій ситуації, зазвичай теж нарікають на вакцину. Та причина криється в іншому. Такий наслідок є свідченням того, що у тварин вже був збудник захворювання, яке і так би обов’язково заявило про себе. А вакцини, хоч і не містять живого вірусу, проте можуть послужили у даній ситуації провокуючим фактором і лише пришвидшили той процес. Тому щеплення кролів слід планувати завчасно, в оптимальні терміни, а не тоді, коли у всіх навколишніх дворах вже починаються проблеми. Та чи завжди якісною є вакцина? Відповідь на це запитання не є однозначною. Вакцини, які виготовляються на вітчизняних та зарубіжних біофабриках проходять обов’язкові дослідження на токсичність та імуногенність, і лише після отримання позитивних результатів допускаються в реалізацію. Та якість вакцин забезпечується не лише в процесі виробництва., але й на шляху доставки до споживача та застосування її в роботі. В усіх закладах торгівлі ветеринарними препаратами — біопрепарати мають зберігатись в холодильниках з дотриманням температурних режимів, згідно інструкцій (в основному це від +2 до +8 градусів). Та чи кожен покупець, придбавши вакцину забезпечить такі режими у процесі її транспортування чи зберігання вдома, аж до моменту використання? Думаю, що далеко не всі. А при недотриманні так званого холодового ланцюга вакцина втрачає свої властивості і це призводить до описаних вище наслідків.

   Ще одне захворювання, яке приносить значні економічні збитки та досить часто реєструється і не лише у кролів — кокцидіоз (еймеріоз). Збудник належить до ряду найпростіших. До інвазійної стадії він проходить  складний цикл розвитку. Джерелом збудника можуть бути забруднені корм і вода, підстилка, предмети догляду. Розрізняють кишкову та печінкову форми прояву хвороби. Остання легко діагностується при забої, через наявність на печінці білих, або жовтуватих плям. Для лікування еймеріозу використовують чимало препаратів, проте, для запобігання хворобі слід забезпечити належні санітарні умови утримання кролів, регулярно проводити прибирання та дезінфекцію кліток, забезпечити тварин якісними кормами та не допускати різкого переводу із сухого типу годівлі на годівлю зеленою масою.

   Неможливо висвітлити всі проблеми, які можуть виникати у галузі кролівництва та вказати шляхи їх вирішення, проте, максимальне дотримання ветеринарно-санітарних правил, створення належних умов утримання та режимів годівлі тварин, а також проведення вчасної вакцинопрофілактики дозволять зберегти кролів у ваших господарствах та забезпечити вас якісною продукцією.       

 

 

Начальник відділу

організації протиепізоотичної роботи

Головного управління Держпродспоживслужби

В Тернопільській області                                                                                       Володимир Марків

 

Кролі за «дідівською» методикою — Умань інфо

23-річний уманчанин Максим Ханапетов почав вирощувати кролів тільки цього року. На перший погляд, здавалося б, звична справа, якою важко когось здивувати. Але досвід пана Максима, без сумніву, унікальний. Він утримує кролів у норах — подібно до того, як вони живуть у природі. По-перше, це дозволяє значно заощаджувати, оскільки не треба купувати клітки.

По-друге, в таких умовах тварини ростуть здоровішими, не потребують штучних кормових добавок, щеплень тощо. Тому їхнє м’ясо безпечніше, натуральніше і корисніше, ніж отримане традиційним способом, не кажучи вже про «промислову» кролятину.  Але про все по-порядку.

Максим виріс у місті, але із самого дитинства цікавився природою. Свого часу батьки хлопця відкрили кафе на самій окраїні Умані.  На подвір’ї закладу молодий чоловік створив справжній міні-зоопарк: олені, фазани, кілька собак, пасіка, раніше були ще й перепілки.

Цього року чоловік одружився і, як годиться, почав думати про нащадків. Усі батьки в першу чергу турбуються про здоров’я дітей, а воно, як відомо, значною мірою залежить від харчування. Нині всі знають, що якими б якісними не були промислові продукти, а все ж їм складно рівнятися до домашніх. Ось так і прийшла ідея самому вирощувати кролів. Адже серед усіх видів м’яса саме кролятину вважають найкориснішою, більше того, її в першу чергу рекомендують у харчування дітям.

Максим уже мав досвід догляду за кролями — в дитинстві допомагав старшому брату. Тому міг би займатися цією справою самостійно. Але для початку потрібні значні інвестиції. Наприклад, лише клітка, розрахована на 20 кролів, коштує близько 3 тис. гривень. А ще треба купити самих тварин, та і догляд за ними не дешевий. Такий варіант молодого чоловіка не влаштовував.

«Знайомі кролівники розповіли, що ще їхні діди колись бачили як кролів тримають у ямах», – розповідає пан Максим. Оце і вся інформація, яка мав на початку. Але вона стала відправною точкою для подальших пошуків. Решту по крихтам збирав в Інтернеті.

Тут треба сказати кілька слів про те, чому існують подібні альтернативні методи кролівництва, адже звичайні клітки здаються зручними та практичними. Справа в тому, що найчастіше кролі хворіють через спеку. Зрозуміло, що встановлювати кондиціонер у присадибному господарстві ніхто не буде. Тому найпростіший спосіб створити прохолоду — поселити кролів нижче поверхні землі.

Є ще один важливий момент. Адже кури чи свині, які живуть на відкритому ґрунті, не мають потреби у штучних кормових добавках. Те ж саме стосується і кролів. 

Але конкретних рекомендацій про те, як розводити кролів у норах, чоловік так і не знайшов. Тому довелося експериментувати. Спочатку вирив у землі яму (приблизно 2 м завдовжки, 2 м завширшки і стільки ж завглибшки). Тоді в одному з кутків почав рити нору: вважається, що буцімто в цьому місці кролі продовжать будувати своє житло. Але в трьох самок, яких господар придбав навесні, були свої плани, і нору вони вирили в іншому кутку «з нуля». Якщо вірити літературі, то такі ходи можуть сягати 40 метрів завдовшки. Над ямою пан Максим установив навіс, щоб захистити кроляче житло від опадів.
Усі роботи та матеріали «потягнули» на 1000 гривень. Причому в такому житлі можна утримувати до сотні тварин.

При такому способі вирощування самців не можна постійно тримати з кролихами, адже тоді неможливо контролювати процес розмноження. Тому господар підселив кроля лише на короткий час. Згодом з’явилося перше потомство — двоє кроленят. Це надто скромний результат, якщо порівнювати з традиційним способом утримування. Чому цифра така мала – невідомо, бо як уже говорилося, процес розмноження контролювати неможливо. І це один із недоліків «дідівського» способу утримання кролів. Проте, господар не женеться за кількістю, адже не вирощує тварин на продаж.

З другого боку, переваг набагато більше, зокрема низька собівартість м’яса. За оцінками пана Максима вона удвічі менша, ніж при традиційному способі утриманням. Але найголовніша перевага — кролятина, вирощена без будь-яких медикаментів і штучних кормових добавок. 

Розведення кроликів в домашніх умовах: на що звернути увагу?

 

• Місце утримання
• годування
• особливості розведенняПарування
• Поширені помилки і основні поради
• Відео

 

Розведення кроликів вважається одним з найбільш вигідних напрямків тваринництва в домашньому господарстві. Високі темпи зростання цих звірків, їх скоростиглість і плідність дозволяють в короткі терміни виправдати вкладені кошти і отримати прибуток від продажу дієтичного м’яса і досить цінних шкурок.

Щоб досягти успіхів в кролівництві, необхідно створити оптимальні умови утримання для тварин і забезпечити їм повноцінний догляд

У даній статті ми розповімо про те, як правильно розводити кроликів в домашніх умовах, на що потрібно в першу чергу звертати увагу початківцю фермеру і як звести до мінімуму помилки і ризики.

Як вибрати місце для утримання кролів

Почати нову справу непросто. Щоб уникнути помилок, необхідно вивчити безліч чинників. Наприклад, перш ніж починати закупівлю кроликів, слід заздалегідь подбати про те, де вони будуть мешкати. Варто сказати, що це не тільки естетична частина питання, а й фактор, який буде в подальшому сприяти тому, щоб кролі швидше розмножувалися, менше хворіли і т. Д.

В першу чергу потрібно мати у своєму розпорядженні певною територією. Ідеальним місцем вважається дача або приватний будинок. Тим, хто не володіє таким багатством, доведеться брати місце в оренду. Що стосується вимог до місцевості, то там не повинно бути занадто легковажно й волого, так як це негативно позначиться на стані здоров’я кролів та кролиць.

Варіанти утримання кролів

Після того як місцевість визначилася, потрібно вибрати найбільш підходящу технологію розведення кролів. Ідеальними умовами вважаються клітини і вольєри, хоча є деякі вузькі поділу щодо того, як можна утримувати вихованців. Про ці технології і піде мова далі. Почнемо з тих, які використовуються на домашніх фермах і налічують до сотні голів.

Ямовий спосіб розведення кроликів

Перший спосіб, про який буде розказано, — це вирощування в ямах. Досвідчені кролівники не рекомендують їм користуватися, не дивлячись на те, що він є найбільш фінансово вигідним для ведення бізнесу. Що являє собою таке розміщення? Це звичайнісінькі викопані ями, в які і поміщаються гризуни, після чого їх закривають залізними сітками, щоб запобігти втечі. Далі, після закінчення якогось часу, кролики будуть плодитися і розривати нори для розміщення свого потомства.

Мінуси Ямова способу полягають в тому, що доведеться постійно залежати від погоди, а тварини будуть міститися в грязі, так як яма передбачає ніякого настилу. З цієї ж причини Ямова способом не розводять шкурковие породи і ті, які вирощуються через пуху, адже якість хутра при такому розкладі буде значно гірше, ніж якби вихованець містився, наприклад, в клітинах. З цієї причини для успішного ведення бізнесу краще віддати перевагу інші варіанти і сказати немає Ямова змістом.

Крім іншого, кролики, що живуть в ямі, будуть частіше хворіти, адже від землі йде вогкість, а це також завдає чимало клопоту господареві кролячій бази і уповільнює розвиток бізнесу.

Утримання кролів в клітках

Це найбільш поширений спосіб кролівництва, яким користуються практично всі власники гризунів. Звичайно, все-таки доведеться витратитися на саму клітку, причому її можна придбати вже готову в магазині або ж зробити самостійно своїми руками. Для того щоб зробити клітку самостійно, знадобляться найпростіші матеріали, трохи кмітливості і працьовитості.

В даний час найбільш популярними є креслення Золотухіна. Ними користуються не тільки в Росії та інших країнах СНД, а й за кордоном, наприклад, в Китаї й Америці. Справа в тому, що пропонована Золотухіним конструкція максимально проста і зрозуміла, її може відтворити навіть людина, далека від конструювання.

За умови промислового змісту використовуються інші способи. Подивимося, де мешкають вухаті на масштабних кролячих господарствах з їх докладним описом.

Шедовими спосіб утримання гризунів

Даний спосіб кролівництва користується величезною популярністю серед власників великих господарств з розведення кроликів. Справа в тому, що за допомогою шедовими методу вдається економити місце, таким чином його можна сміливо назвати найбільш компактним з усіх наявних. Клітини розташовуються в кілька ярусів, частіше за все в 2. Ви напевно бачили на фото або відео такі ферми.

Завдяки застосуванню шедовими способу, можна на 12 кв. м розташувати близько 45 клітин.

Говорячи про шедовими методі, не можна не сказати про основне нестачі: це занадто висока вартість, що відлякує багатьох тваринників, особливо тих, хто має справу з кролями вперше. З цієї причини не варто пробувати свої сили в тваринництві, починаючи з шедів, краще перейти на них в процесі збільшення поголів’я кроликів, якщо справи підуть успішно.

спосіб Михайлова

Зрівнятися з вартістю шедовими розміщення може тільки система Михайлова: така методика є найдорожчою з усіх існуючих. Однак висока ціна є виправданою, оскільки метод дозволяє розводити будь-який різновид породи, є найбільш практичним і швидким, що також важливо в питанні вирощування кролів і побудові ефективного бізнесу.

Система Михайлова передбачає облаштування так званих мініферм, які бувають автоматичними або напівавтоматичними. Справа в тому, що такі міні-ферми влаштовані так, щоб втручання з боку людини було мінімальним. У найкоротші терміни вдасться виростити дорослого кроля з маленького крольчонка, так як для цього створені всі умови. Це пояснюється тим, що тут Михайлов застосував технології вирощування кроликів акселератів (Акселеративне вирощування), що дозволять максимально прискорити процес набору маси. В середньому час скорочується на 1-3 місяці, що грає на руку при прорахунку бізнес-плану і підвищує рентабельність проекту з подальшою перспективою.

вибір породи

Прийнявши рішення зайнятися розведенням кроликів, необхідно визначитися з метою своєї діяльності. Деякі вирощують вухатих вихованців з метою продажу кроленят, в такому випадку варто зупинитися на декоративних породах. Зараз вони дуже популярні, таких вихованців здобувають в якості домашніх улюбленців. Інші породи кролів:

М’ясні . Таких кроликів вирощують заради м’яса. Вони швидко набирають вагу, вже через 6-7 місяців від кожної особини вдається отримати не менше 4 кг дієтичного кролячого м’яса. Чисто м’ясні породи не відрізняються високою якістю шкурки. До них відносяться каліфорнійський і новозеландський білий кролик.

Пухові . Таких звірів вирощують виключно заради їх шкурки. М’ясо кроликів пухових порід також можна вживати в їжу, але воно не так високо цінується на ринку. Прийнявши рішення розводити кроликів заради продажу якісного хутра, варто звернути увагу на породи білий пухової або ангорський кролик.

М’ясо-шкурковие . Цей напрямок є універсальним. Вирощуючи кроликів радянська шиншила, чорно-бурих або сріблястих, можна отримувати подвійну вигоду — м’ясо та шкурки хорошої якості.

Загальні рекомендації з облаштування крільчатника

Незалежно від того, яким способом фермер віддасть перевагу, потрібно дотримуватися такі рекомендації щодо змісту кролів:

• Бажано розмістити кроликів на певній відстані від інших домашніх тварин і птахів в тому числі.
• Якщо ви вибираєте вуличне розведення кролів, потрібно подбати про те, щоб територія з гризунами була обнесена деревами. Звичайно, ця рекомендація більше стосується не маленьких домашніх ферм, а промислових господарств. Найбільш підходящим деревом вважається береза. Якщо дозволяє територія і бюджет, то дерева потрібно посадити і на території самої ферми. Все це потрібно, для того щоб створити для тварин необхідний клімат. Крона дерев буде служити захистом від палючого сонця влітку, а також уберігати від холоду в зимовий час.

Класифікація клітин

Клітини для крільчатника класифікують за умовами утримання, за характеристиками мешканців, за матеріалами і типом конструкції.

Залежно від умов, в яких розміщується крільчатник, виділяють зовнішні стаціонарні та пересувні приміщення, стаціонарні конструкції для приміщень, а також клітини з вигульними вольєрами. Клітини можуть призначатися для одиночного змісту самців, для молодняка (розміщується групами по 5-15 штук), а також для утримання кролиці з новонародженим потомством.

Матеріали, з яких виготовляють клітини:

• метал, металева сітка;
• дерево;
• фанера;
• пластик (зазвичай використовується для піддонів).

Який інвентар потрібно

Тепер, коли місце для розведення кролів вибрано, а метод розведення визначено, потрібно приступати до виготовлення і закупівлі необхідного обладнання та інвентарю, який буде потрібно для догляду за гризунами. Сюди відносять:

• Поїлки і годівниці. Їх необхідно закуповувати з розрахунку 1 шт. на 3 особин.
• Пластикові відра. Їх використовують в якості тимчасової ємності для води і їжі.
• Вози, тачки або кошика на колесах. Вони значно спрощують транспортування кормів, зокрема, зелені і сіна. Крім того, не потрібно забувати про те, що важливо буде регулярно чистити клітки, після чого утилізувати гній.
• Мітла для прибирання території, яку займає фермою.
• Правилки, на які натягують кролячу шкуру. Вони потрібні тим, хто планує займатися обробкою шкурок.
• Інструменти, необхідні для забивання поголів’я. Більш того, необхідно обладнати спеціальне приміщення, в якому буде відбуватися забій тварин, його називають м’ясним цехом
• Журнали для ведення обліку тварин (в них заноситься кількість годувань, дані про щеплення, норми розвитку молодняка і так далі).

Варто сказати і про те, що в міру зростання чисельності кроликів і розвитку ферми будуть потрібні помічники, так як в поодинці справлятися вже не вийде. Багато справляються за допомогою участі всієї родини, тобто кролівництво в домашніх умовах стає сімейною справою. Однак краще, якщо в процесі розведення кроликів будуть задіяні ті люди, які є фахівцями в цій справі. Вони зможуть поділитися досвідом в питанні догляду, годування, розмноження і лікування гризунів.

Якщо не вдасться знайти собі в помічники таких людей, то можна звернутися за допомогою до аматорським відео і фото уроків, які діячі кролівництва викладають в мережі інтернет.

Основні помилки при розведенні і поради кролівникам

Часті помилки, що виникають при розведенні кролів: — рідкісна зміна води для пиття; — недостатня прибирання клітин; — зневага вакцинацією і послугами ветеринара, самолікування тварин; — неправильне поводження з вихованцями; — неякісна їжа; — розміщення тварин на протязі або сонце.

З недавнього часу кролівництво в Росії початок завойовувати все більшу популярність серед початківців фермерів. І це не дивно. Адже розводити кроликів легко і просто. До того ж це чудова можливість забезпечити сім’ю м’ясними делікатесами чудової якості, поліпшити фінансовий добробут, продаючи кролячу м’ясну продукцію і шкурки.

годування кроликів

Важливим є і питання годування. Важливо розуміти, який корм підходить гризунам. Незважаючи на те, що кролики — мініатюрні тварини, їх апетиту може позаздрити кожен. Вони потребують величезній кількості корму, причому потрібно врахувати і те, що він повинен бути різноманітним:

• До складу корму для кроликів повинен входити комбікорм. Цей пункт складає більшу половину раціону тварини.
• Сіно. Ця складова меню покращує процес перетравлення їжі в шлунково-кишковому тракті кроликів.
• Гілки фруктових дерев, а також дуба і берези. При цьому хвоя суворо заборонено для введення в раціон. Чому в раціоні кролів повинні бути присутніми гілки? Це потрібно, щоб ушастики сточували свої зуби, та й самі тварини з задоволенням жують деревину.
• Овочі. Кролики люблять овочі, також в їх складі присутній маса вітамінів. Винятком є ​​картопля, звичайна капуста і буряк. Всі ці компоненти можуть привести до серйозних проблем з боку шлунково-кишкового тракту.
• Гризуни потребують зелені, вона також корисна для здоров’я кроликів. Тут також є трави, від яких потрібно відмовитися: це молочай, жовтець і конвалії.

Світловий день і санітарно — гігієнічні норми

Люблять кролики догляд! Це варто пам’ятати, як новачкам, так і досвідченим кролівникам. Для нормальної життєдіяльності вихованців створюють потрібний мікроклімат:

• температуру;
• вологість;
• напрямок, швидкість руху, склад повітря;
• тривалість світлового дня;
• освітленість приміщення.

Кролівники повинні контролювати тривалість світлового дня (особливо взимку або при розміщенні кроликів всередині приміщень).

Освітленість впливає на: — статеву активність; — обсяг еритроцитів в крові тварин.

Світловий день кролика повинен бути не менше 16 — 18 годин.

Освітленість повинна бути різною: Самці-виробники вимагають більше світла — 100-125 Люкс, кролиці з кроленятами теж має бути світло — 40-70 Люкс, а молодняку ​​досить — 20 Люкс.

Влітку тварини потребують сонячному світлі (насичення вітаміном Д), але при вуличному розміщенні рекомендується обмежити клітини від прямого попадання, контролювати, щоб вухаті НЕ перегрілися. При закритому утриманні вікна встановлюють так, щоб крізь них потрапляло сонячне світло з вулиці.

Площа вікон в приміщенні для кролів = 10% від площі підлоги цього приміщення.

На зиму крільчатника рекомендується облаштувати штучними світильниками.

Особливості розмноження кроликів

Якщо ви плануєте розводити кроликів, то ви повинні бути інформовані про особливості розмноження цих тварин. Незважаючи на їх плодючість, для того щоб поголів’я збільшувалася, потрібно створити певні умови для спаровування, а також врівноважити відсоток співвідношення самців і самок.

Для того щоб створити максимально прийнятні умови, на 1 кроля має припадати близько 5 кролиць. Якщо самців буде більше, то велика ймовірність того, що виникнуть сварки і бійки між самцями. Найпростіше розселити кроликів по групах, в одній такій групі буде близько 5 самок. Потім потрібно періодично підсаджувати в жіночу компанію кроля-запліднювач. Важливо не селити їх разом на постійній основі: дорослі особини можуть затоптати молодняк.

Оптимальні розміри клітин

Розміри конструкцій відрізняються, залежно від віку і розмірів тварин. Загальні рекомендації тут виглядають наступним чином:

• для розміщення кролиці з виводком потрібно простір довжиною 170-180 см, шириною — 1 м і висотою до 70 см;
• в груповий клітці для молодняка площа розраховують виходячи зі співвідношення на 1 особину — 0,2 кв.м. приміщення;
• поодинокі клітини для вирощування молодняка виконують площею близько 0,5 кв.м. з висотою стінок не менш 35 см;
• для великих дорослих кролів потрібно простір розмірами не менше 60 см в ширину, 120 см в довжину і 50 см у висоту.

крільчатник

Як відбувається злучка

До парування або парування допускаються тільки здорові особини. У кроликів допускається інбридинг, тобто спаровування близькоспоріднених особин. Щоб відібрати таких, потрібно ретельно оглянути їх на предмет зовнішніх ознак хвороби, а також провести поверхневий аналіз поведінки. Якщо кроль здоровий, то його зовнішній вигляд буде вгодованим, а поведінка — бадьорим. Приблизний вік, який є оптимальним для першої злучки: це 4-5 місяців. Період фертильності триває у самок близько 4 років, хоча бувають і винятки з правил у деяких порід.

Правильно проводити спаровування на території самця: так кроль буде відчувати себе максимально впевнено. Підбирати слід тільки самок, які в даний час знаходяться в полюванні. Як визначити, чи готова самка до спаровування? На це будуть вказувати наступні ознаки:

• при пальпації вушні раковини стають гарячими;
• з’являється помітна набряклість статевих органів, можуть з’явитися прозорі виділення із статевої щілини;
• самка може зробити подобу гнізда з власного пуху, який сама ж у себе і вищипала.

Що стосується часу, то ідеальним вважається ранній ранок або ж пізній вечір, найкраще випробувати самця 2 рази в зазначені раніше тимчасові проміжки. Щоб зрозуміти, чи пройшла злучка вдало, потрібно уважно поспостерігати за тим, як веде себе самець безпосередньо після спарювання. Якщо він завмирає і залишається нерухомим якийсь час, то з великою часткою ймовірності можна стверджувати, що все пройшло вдало.

Щоб зрозуміти на ранньому терміні, завагітніла самка, потрібно подивитися, як вона реагує на кроля, що знаходиться в безпосередній близькості. Якщо вона усіляко намагається від нього отбрикнуться, то швидше за все вона вагітна, і вже через 30-40 днів можна чекати появи маленьких кроленят.

Визначення вагітності у кролиць

вагітна кролиця

Досвідчені кролівники проводять контрольне спарювання через 5-6 днів після першого покриття. Найчастіше, вже вагітна самка не дається для повторної злучки самця.

Через 2 тижні можна спробувати прищепити живіт покритої самки. Тварина виймають з клітки, розгортають до себе головою, тримаючи самку за шкуру в області крижів однією рукою. Інший в цей час промацують живіт, у вагітної кролиці в задній половині можна відчути зародків як одну або дві паралельні один одному ланцюжка. Величина зародка в цей час становить 2-3см. Промацування роблять дуже акуратно, щоб не пошкодити малюкам і не викликати штучні пологи.

Коли до пологів залишається 5-7 днів, самка починає готувати гніздо і підстилку для дитинчат. Для цього вона використовує солому і траву з ясел. За добу до окролу, кролиця вищипує власний пух і вистилає їм гніздо.

Яким повинен бути догляд за новонародженими кроленятами

Після окролу на світ з’являється близько 7 нових маленьких кроленят. Вони виглядають зовсім крихітними, про це свідчить і їхня вага: близько 60 м Також можна сказати про те, що в перший час новонароджені малюки є повністю беззахисними, тому що народжуються повністю сліпими і без хутра. Щоб у кролиці було досить молока, потрібно забезпечити їй постійний доступ до води. Якщо цього не буде зроблено, є велика ймовірність, що молодняк буде з’їдений власної ж матір’ю.

Під час грудного годування потрібно мінімально втручатися в природний процес, тому що кролик, на якому залишився запах людини, з великою часткою ймовірності може бути відкинутий кролицею, після чого його чекає неминуча смерть. Після того як кролики досягнуть віку в 1 місяць, потрібно їх забрати від матері і розселити в окремі клітини. У такому віці щільність посадки може бути близько 12-18 голів на одну клітку.

білування тушки

Оброблення проводять, повісивши кролика на якусь гілку або жердина. Прив’язують тушку шпагатом за задні лапи. Для кращого зливу крові відразу після умертвіння потрібно перерізати перенісся. Шкірку знімають як панчоха, розрізавши її навколо задніх лап і прорізавши по їх внутрішній стороні.

З тушки видаляють всі органи, крім печінки, з якої акуратно зрізують жовч. Перед приготуванням тушку бажано витримати в холодильнику не менше 24 годин. За цей час відбудеться часткове розщеплення білка, і м’ясо стане смачніше.

Як бачите, зміст кроликів в клітинах — справа досить-таки клопітка. Однак при дотриманні правил годування найголовніше — чистота в клітках, і успіх цього підприємства гарантований.

Як відкрити кролячу ферму. Бізнес-план. — Franchising.ua

Україна — аграрна країна, і будь-яка галузь тваринництва має гарний потенціал. Кролівництво було популярним у нас кілька десятиліть тому, і сьогодні, після певного занепаду, воно починає відновлюватися.

Як показує досвід інших країн, кролівництво — цікаве, прибуткове, швидко окуповується. Це ббезвідходне виробництво: у справу йде все: і м’ясо, і шкурка. Позитивним моментом є те, що в Україні спостерігається чітка тенденція на заміщення безпородних кроликів високопородними. Зростає якість м’яса і шкурок, підвищується ефективність.

Прорив у ветеринарії
Українські кролівники взяли до уваги, що фінансові витрати на сучасну вакцину повертаються сторицею і позбавляють кролівника від традиційних ризиків. Поспілкувавшись з власниками кролячих ферм, ми прийшли до висновку, що основною проблемою проектів Startup у кролівництві є не економічна чи фінансова, а психологічна проблема.
 Підприємці-початківці думають, що промислове розведення кроликів — справа дуже ризикована, зокрема, через часті хвороб цих тварин. Але важливо відзначити, що протягом останніх 10 років мікробіологами та ветеринарними фармацевтами проведений реальний прорив у профілактиці захворювань тварин. Зараз на ринку України є до десятка вакцин різних виробників, які можуть ефективно протидіяти захворюванням.

Рентабельний бізнес
При наявності можливості забезпечити здоров’я поголів’ю, кролівництво — один з найбільш рентабельних видів фермерського господарства. Ніякий інший вид сільськогосподарських тварин не може зрівнятися з кроликами за швидкістю зростання. Кроленята при народженні важать всього 40-90 р. Але вже до шостого дня їх вага подвоюється, а у віці 1 місяця збільшується в 10-12 разів. Кролики дуже швидко розвиваються. Вже у віці 3,5-4 місяців кролиці досягають статевої зрілості. Кожна з них приносить за окрол 6-9, іноді до 14 кроленят. А за рік від однієї кролиці можна отримати 6-8 і більше окролів. За рік 100% окупність.
Поголів’я кроликів на Україні сьогодні становить приблизно 1,5-2 млн особин. До 98% тварин містяться в індивідуальних підсобних, і 2% — у фермерських господарствах.
Українські кролівники організовуються як в регіональні, так і в загальнореспубліканські об’єднання. Проводяться семінари, науково-практичні конференції. Найчастіше ядром, об’єднуючим навколо себе кролівників в тому чи іншому регіоні, є племінні господарства.

Професіоналізм і любов
Найголовніше при відкритті кролячого господарства — це любов до тварин. Відкрити бізнес з розведення кроликів не так складно, але є труднощі, які необхідно враховувати і з якими доведеться мати справу. Насамперед, важливо правильно підібрати персонал. У цьому бізнесі кадри вирішують багато чого, так як тварини ніжні, чутливі до стресів, хвороб, і непрофесійний підхід може погубити все поголів’я. Кролівництво — дохідна, але найскладніша з усіх галузей тваринництва, і успіх у розведенні кроликів, в значній мірі, залежить від всієї технології, а головне — від професіоналізму кролівника. Хороший кролівник повинен подбати про якість приміщень і кліток для тварин. Також потрібно серйозно підійти до пошуку ветлікаря (проведення вакцинації), підібрати правильне харчування. Потрібно дбати про майбутнє господарства: прибуток пускати на розвиток, використовувати сучасні технології виробництва.
Дмитро Титаренко, директор з розвитку Компанії AgroEx, офіційний представник головного фермерського порталу Fermer.ru: «Спочатку я не ставив завдання побудувати бізнес, а просто розвивав проект без оглядки на фінанси. Хотілося створити щось подібне моделі ІКЕА, коли все зрозуміло і доступно. Почати власний бізнес можна з двох кроликів, як би просто це не звучало. Ці тварини відрізняються дуже високою плодючістю, і, при правильному підході, кролиця може дати 5-6 окролів на рік (це більше 40 кроленят), що після відгодівлі складе близько 100-120 кг м’яса. Однак, домогтися гарних результатів можливо лише при забезпеченні необхідних умов утримання кроликів. Умови утримання є дуже серйозним чинником в отриманні якісної продукції кролівництва».

З якої суми стартувати?
На думку Дмитра Титаренка, мінімально виправданий старт кролячої ферми — $10 000 — це 10 шт. двоярусних мініферм для річної експлуатації з корисною площею по 3 кв.м. «Даної суми достатньо, щоб закупити обладнання для міні-ферми на 16 кролематок. Необхідно враховувати додатковий простір для молодняка і самців-виробників», — вважає Дмитро Титаренко. — Надалі, при нарощуванні ферми, можна повністю відмовитися від самців-виробників і використовувати систему штучного осеменіння, яка, в свою чергу, підвищує ефективність, і знижує похибку в продуктивності всієї ферми. Для дрібних фермерів або тих, хто хоче спробувати себе в цьому бізнесі, старт можливий і з 2-х міні-ферм (на 3 кролематки і самця). Сума старту до $ 2500 (з урахуванням поголів’я). У даному випадку повільніші темпи розвитку, але невеликі вклади і ризики. Подальший розвиток і нарощування бізнесу може проходити без додаткових вкладень за рахунок реінвестування. Темпи розвитку: збільшення продуктивності в 2 рази кожен рік.
Ціна маточного поголів’я
За словами Дмитра Титаренко, в залежності від ринкових цін вартість маточного поголів’я становить до $800 відповідно від обраної породи (16 кролематок). 16 кролематок — та кількість, яка зможе давати щомісячний обсяг м’яса близько 200 кг. Дана продуктивність дозволить розпочати роботу з налагодження каналів збуту з торговими мережами на початковому етапі. Надалі виробництво нарощується, виходячи зі зростання обсягів продажів.

Доходи і витрати
Витрати на персонал і вакцинацію покриваються за рахунок продажу шкурок, які, як правило, не враховуються в доходах. Якщо раціонально вибудувати цикли на виробництві, то можна скоротити число днів з основними роботами на фермі до 2 на тиждень, а в інші дні проводити тільки огляд поголів’я. Всі шкурки йдуть на експорт. Залежно від їх якості вартість коливається від 8 до 30 гривень за штуку. Після повного запуску циклу на виробництві щомісячний дохід становить близько $1200. Додатковою статтею доходу є продаж племінного поголів’я живою вагою, рентабельність якого практично в 5 разів вище м’ясного. Однак воно сезонне.

Бізнес-план фермы


Сума початкових інвестицій:

• заупка кроликів (максимум) : 16 х $50 = $800
• закупка кліток та допобладнання: 10 х $1тис. = $10 тис.
• інтернет-сайт: $350  (можна акаунт интернет-магазину на Prom.ua)

Всьго: близько $11 тис.

Витрати в місяць:

• корм: 700 кг х $0,75  = $525
• зарплата персоналу: $300  (часткова зайнятість)
• реклама: нема необхідності при використанні торгових порталів

Всього: близько $825

Доходи в місяць:

• М’ясо: 160 голів х 1,5 кг х $/кг 6,25 = $1,5 тис.
• Шкурка: 160 шкурок х $1 = $160

Прибуток перед оподаткуванням:

• $1,5 тис. + 160 – $525 – $300 = $835 (Рентабельність близько 50%)

Кролячі клопоти. Як розводити та утримувати кроликів

http://miragro.com

Господарі, які розводять на подвір’ї свійських тварин, якщо не мають кроликів, то принаймні хоча б раз мали задум їх завести.

Та декого зупиняє нібито складність утримання, декого – чутки про хворобливість, що інколи «викошує» цілі кролячі родини. Варто розглянути, чого насправді треба боятися, а чому можна завадити, і тоді жодних прикростей у розведенні корисних тварин не буде.

Порівняно з більш звичними нам курятиною, свининою, яловичиною, телятиною, у кролятині білків найбільше, а холестерину – найменше. До того ж, білки якнайповніше засвоюються організмом – на 90 %. Не будемо перевантажувати читача детальними розмірковуваннями про лецитин, мінерали, вітаміни тощо, присутні у м’ясі кроля, усі й так багато чули про його корисність. Саме зважаючи на, можна сказати, лікувальні властивості, ніжне м’ясо кроликів особливо рекомендовано вживати літнім людям і тим, хто має серцево-судинні захворювання, цукровий діабет, а також хвороби шлунка, кишечнику, печінки.

Друга корисна похідна – кролячі шкурки, те саме славнозвісне цінне хутро – приємне на дотик, пухнасте, що виграє різними відтінками від сніжно-білого і до глибокого чорного та вражає вигадливістю плямистих і цяткованих візерунків.

Тож, слідуючи цим двом «корисностям», й основні породи кролів поділяються на м’ясні (зараз популярні бройлерні) та хутряні. Щоправда, є ще й м’ясо-шкуркові та пухові породи.

Хоча вважається, що розведення кролів не потребує значного докладання рук, все одно, людська праця – чи не єдина найтрудовитратніша частка цієї справи.

Кролячий пансіон

Кролі – найплідніші сільгосптварини. За один окріл самиця може привести від 6-8 до 12-15 дитинчат, а на рік у кролиць буває по 4-6 окролів (до того ж, о будь-якій порі року). Та й ростуть пухнасті довговухі нечувано швидко. Вже до шостого дня вага кроленяти подвоюється, а в місячному віці вона збільшується вже вдесятеро. (Для порівняння: вага поросяти подвоюється до 15-го дня, теляти – до 47-го.) От уже можна й підрахувати поголів’я та вигоду, почути жаданий шурхіт злічуваних купюр.

Серед плюсів на користь розведення кролів – простота утримання та можливість розташування на невеличкій площі. Тримають тварин переважно у клітках, для присадибних господарств це набагато зручніше, та й практичніше, ніж у загонах, бо дозволяє вільно проводити всі необхідні маніпуляції з догляду за опіканцями – від годування до парування. До того ж, клітки (якщо вони не стаціонарні, а переносні), можна ставити одна на одну у два-три яруси, що значно економить місце. Невибагливі кролі цілий рік добре почуватимуться на вулиці (ну хіба що за мінусової температури або під час окролу кліті можна внести до повітки). Це не просто вимушений або можливий захід, а вельми рекомендований, бо перебування надворі якнайкраще впливає на трусиків, з якого боку не поглянь: і опір захворюванням підвищується, і хутро стає якіснішим, і продуктивність зростає. А тепла шубка не дає їм змерзнути і взимку.

Якому ж меню віддають перевагу невибагливі кролики? Непосвяченому здається, що траві або сіну. Але самим сіном не досягнеш збалансованості корму, а вона чи не наполовину підвищує продуктивність кроля та його якість за всіма показниками. Отже, над раціоном слід почаклувати. В ідеалі він має складатися із зерна та вітамінних домішок з високим умістом білка. Така кормова суміш, по-іншому комбікорм, повністю вгамує потребу тварин у вітамінах і мінеральних речовинах. Інакше до основного корму доведеться додавати потроху кухонну сіль, кісткове борошно, крейду, риб’ячий жир тощо.

Кролики є надзвичайно вигідними в розведенні ще й завдяки тому, що корму для них треба удвічі-утричі менше, ніж, скажімо, для птиці чи свині. Чому?

Слід знати (і пам’ятати) про таку особливість кролів як нічне поїдання власного калу (не твердого, а м’якого зеленого), по-науковому це називається копрофагією. Так кролі прискорюють процес травлення їжі, оскільки їхній кал містить необхідні для цього ферменти. До того ж, кролячий кал являє собою багатий за білками та вітамінами субстрат. Надто, якщо кролів позбавити можливості копрофагії, вони худнуть, втрачають масу, можуть навіть загинути, а в самиць це негативно впливає на перебіг вагітності й внутрішньоутробний розвиток кроленят. Отже, поїдання калу кролями є природною біологічною потребою та дозволяє якнайповніше використати корм.

Профілактика завжди краща за лікування

Кращі друзі кролівників – чистота й дезінфекція, а ще – слушно й правильно проведена вакцинація. Це важливі інструменти, якими, якщо правильно користуватися, можна упередити ситуації, коли хвороба за одну-дві ночі викошує все поголів’я. Дотримуючись вчасності та регулярності цих процедур, можна убезпечити вуханів від багатьох кролячих захворювань. Інколи господарі скаржаться, що вакциновані кролі все одно підхоплюють хворобу. Та не всі на початку звертають увагу на те, що вакцини, залежно від їх різновиду або виробника, можуть починати діяти не відразу, а лише, приміром за два тижні. Тож у час до початку дії до вакцинованих кролів слід ставитися так само, як і не до вакцинованих. Важливо також ретельно дотримуватися строків щеплення та віку тварин, в який його слід робити, не раніше й не пізніше рекомендованих термінів, бо їх порушення може звести нанівець усі докладені зусилля.

Прихильники закордонних вакцин мають пам’ятати, що не завжди закордонне означає краще за вітчизняне. Зараз в Україні виробляють препарати – вакцини та дезінфікувальні засоби, здатні надійно захистити ваших годованців від недуг.

Цікаво
– Кількість окрасів кроликів сягає 150, а кольорів очей лише п’ять: коричневий, сіро-блакитний, блакитний, рожевий, мармуровий.
– Завдяки будові ока кролик може дивитися назад, не повертаючи голови.
– Кролики мають чутливі вуха, які вони можуть повертати у будь-якому напрямі. Через вуха регулюється також температура тіла тварини.
– У жирі на кролячих вухах виробляється вітамін Д. Тому, помивши вушка, кролі облизують лапи, таким чином отримуючи цінну вітамінну добавку.
– Самиця кролика має двійчасту матку, тому вона здатна виношувати одночасно два поноси від різних самців.
– Спекотного літа репродуктивна функція в самців може припинитися, і відновитися з настанням прохолодної погоди.
– Кролики не потіють, оскільки не мають потових залоз. Піт може виділятися лише через подушечки на лапах.
– Хутро кроля не алергічне, тому людині можна не боятися алергії.

У тему. 23 лютого в Харкові у рамках спеціалізованої виставки «Фермерське господарство – 2013» відбувся науково-практичний семінар, присвячений розвиткові приватного кролівництва в Україні. Зокрема, було поінформовано про новостворену Асоціацію кролівників України, яка надаватиме допомогу кролівникам-початківцям з різних питань: юридичних, ветеринарних, щодо утримання та раціону тощо.

Тетяна Матвієнко, матеріал з газети «Слобідський край» №27 від 02.03.2013

клеточно-опосредованный трансгенез у кроликов: животные с химерным и ядерным переносом1 | Биология размножения

Аннотация

Способность выполнять точную генную инженерию, такую ​​как нацеливание на гены у кроликов, будет способствовать биомедицинским исследованиям, например, путем создания генетически определенных кроличьих моделей болезней человека. Это пока невозможно из-за отсутствия функциональных эмбриональных стволовых клеток кролика и высокой внутриутробной и перинатальной смертности, связанной с переносом ядер соматических клеток кролика.Мы исследовали культивируемые плюрипотентные и мультипотентные клетки на предмет их способности поддерживать производство жизнеспособных животных. Были получены предполагаемые эмбриональные стволовые (ES) клетки кролика, и было показано, что они способны к плюрипотентной дифференцировке in vitro и in vivo. Мы сообщаем о первых живорожденных химерах кроликов, происходящих от ES. Мезенхимальные стволовые клетки кролика (МСК) были получены из костного мозга, и мультипотентная дифференцировка была продемонстрирована in vitro. Перенос ядра осуществляли с обоими типами клеток, а развитие эмбриона оценивали in vitro и in vivo.МСК кролика были заметно более успешными, чем клетки ES в качестве доноров ядра. МСК трансфицировали флуоресцентными конструкциями репортерного гена и оценивали на способность к переносу ядра. Трансфицированные МСК поддерживали развитие с такой же эффективностью, как и нормальные МСК, и привели к появлению первых живых клонированных кроликов из генетически измененных МСК. Реактивация экспрессии репортерного гена флуоресценции в реконструированных эмбрионах была исследована как средство идентификации жизнеспособных эмбрионов in vitro, но не была надежным предиктором.Мы также исследовали серийную передачу ядер как средство спасения мертвых животных.

Введение

Кролики — важные лабораторные животные. Способность выполнять точную генную инженерию, такую ​​как нацеливание на гены у кроликов, может принести большую пользу биомедицинским исследованиям, позволяя, например, разрабатывать генетически определенные кроличьи модели болезней человека. Это пока невозможно из-за отсутствия функциональных стволовых (ES) клеток кролика и неэффективности переноса ядер соматических клеток кролика.

Перенос ядра из культивируемых соматических клеток был разработан отчасти для того, чтобы обойти необходимость для ES-клеток генерировать трансгенных и нацеленных на гены крупных животных [1, 2]. Однако технически это оказалось сложнее, чем предполагалось изначально. Теперь, спустя более 10 лет после нашей первой демонстрации, есть только несколько примеров нацеливания генов у млекопитающих, кроме мышей: COL1A1 у овец [2], PRNP у овец, крупного рогатого скота и коз [3-5] , GGTA1 у свиней [6, 7], IGH у крупного рогатого скота [4] и CFTR у свиней [8].

Используемый тип клеток является важным фактором переноса ядра, особенно когда целью является создание генно-целевых животных. В идеале используемые клетки должны широко размножаться в культуре, выдерживать процедуры генетических манипуляций, поддерживать гомологичную рекомбинацию с разумной эффективностью и подвергаться эффективному перепрограммированию после переноса ядра.

Мышиные ES-клетки в высшей степени подходят для нацеливания на гены, и некоторые данные указывают на то, что они также являются более успешными донорами ядра, чем дифференцированные типы клеток.Эмбрионы, клонированные из ES-клеток, развивались с большей эффективностью [9, 10], чем эмбрионы из взрослых клеток, таких как кумулюс [11], фибробласты [12] или клетки Сертоли [13], что позволяет предположить, что эпигенетическое состояние ES-клеток может быть более похожим на ранние эмбрионы. Это подтверждается тем фактом, что бластоцисты, полученные из ES-клеток, достоверно экспрессировали Pou5f1 (ранее известный как Oct4 ) и родственные гены плюрипотентности, тогда как только 62% бластоцист, клонированных из кумулюсных клеток, реактивировали эти гены [14], что, вероятно, связано с к довольно открытой, более эухроматической конформации хроматина, наблюдаемой в ES-клетках [15].

Проблема заключается в сложности получения и поддержания дефинитивных ES-клеток или эквивалентных индуцированных линий плюрипотентных стволовых клеток от многих видов. ES-подобные клетки были описаны у кроликов, но, как и у многих других млекопитающих, окончательная функция образования химер не была продемонстрирована [16-19]. Недифференцированные ES-подобные клетки еще не использовались для переноса ядер кроликов, хотя живые кролики были получены с использованием дифференцированных производных ES [16].

Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются привлекательной альтернативой ES-клеткам для создания генно-целевых животных.МСК легко получить из костного мозга или жировой ткани; они хорошо размножаются в культуре и успешно используются для переноса ядер у крупного рогатого скота и свиней [20–23]. МСК могут трансфицироваться и сохранять свою мультипотентную идентичность, и они поддерживают доимплантационное развитие эмбрионов с переносом ядра со скоростью, аналогичной неманипулированным МСК [21, 22].

Теперь ясно, что успех переноса ядра заметно различается у разных млекопитающих, причем кролики — один из наиболее сложных исследованных видов.Помимо нашей группы, только три другие группы преуспели в создании клонированных кроликов [24–27], включая одного трансгенного кролика с зеленым флуоресцентным белком (EGFP) [28]. Исследователи постоянно сообщают о тяжелых потерях во время беременности или в течение первых нескольких недель жизни. До тех пор, пока не будут определены критические факторы или не будут разработаны методы исправления, будет трудно распространить на кроликов нацеливание на гены, основанные на клетках.

В этом исследовании мы получили плюрипотентные и мультипотентные стволовые клетки кролика и сравнили их полезность для клеточно-опосредованного трансгенеза путем переноса ядра.Мы проверили, могут ли МСК поддерживать полноценное развитие клонированных эмбрионов после генетических манипуляций. Мы также исследовали полезность последовательного переноса ядер как средства повышения жизнеспособности клонированных кроликов и спасения генотипа ценных, но неживых животных.

Материалы и методы

Эксперименты на животных были одобрены комитетами по этике экспериментов на животных LMU в Мюнхене и TU в Мюнхене и проводились в соответствии с нормативными документами Европейского Союза по уходу и использованию экспериментальных животных.Если не указано иное, все химические вещества и среды были приобретены у Sigma Chemical Co.

Получение плюрипотентных стволовых клеток и характеристика

Предполагаемые ES-клетки кролика получали способами, аналогичными описанным для мышей. Эмбрионы кроликов получали промыванием эксплантированных яйцеводов суперовулированных кроликов-альбиносов Зика через 19 часов после естественного спаривания и культивирования in vitro до поздней стадии или стадии вылупления бластоцисты. Самок кроликов суперовулировали путем внутримышечной инъекции 100 МЕ (международных единиц) хорионического гонадотропина лошади (ЭКГ; Интергонан, Интервет) и 100 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ; Овогест, Интервет) внутривенно через 72 часа.Вылупившиеся бластоцисты переносили непосредственно на питающий слой митотически инактивированных фибробластов плода мыши; неоткрывающиеся бластоцисты механически препарировали и затем переносили в питающий слой. Эксплантаты кроликов культивировали в среде ES-клеток, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS; PAA Laboratories), предварительно кондиционированной питающими клетками и дополненными 10 нг / мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов-2 (FGF2; PromoKine) и человеческого LIF (лейкемия). ингибирующий фактор). Первичные эксплантаты эмбрионов и культуры ранних пассажей диссоциировали с использованием Accutase (PAA Laboratories) и механического растирания.LIF не требовался для более длительного культивирования.

Окрашивание щелочной фосфатазой проводили с использованием набора для обнаружения SigmaFAST BCIP / NBT AP. Для иммуноцитохимического определения маркеров клеточной поверхности клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 мин при комнатной температуре (КТ), промывали и обрабатывали блокирующим раствором (Roche Diagnostics, GmbH) в течение 15 мин при КТ. Затем клетки инкубировали с первичными антителами (см. Дополнительные материалы и методы ; , все дополнительные данные доступны на сайте www.biolreprod.org) в течение ночи при 4 ° C. После отмывки клетки подвергали воздействию вторичных антител (см. Дополнительные материалы и методы ) в течение 1 часа при комнатной температуре. Иммуноцитохимическое определение POU5F1 проводили аналогичным методом, но клетки были проницаемы обработкой 0,1% Triton X-100 перед инкубацией с первичными антителами.

ОТ-ПЦР выполняли на РНК, экстрагированной из линий недифференцированных кроличьих ES (rbES) клеточных линий. Один микрограмм РНК, обработанной ДНКазой, использовали в системе Superscript III One-Step RT-PCR (Invitrogen).Утвержденные наборы праймеров, используемые для ОТ-ПЦР, перечислены в дополнительной таблице S1. Условия для RT-PCR были следующими: 55 ° C в течение 30 мин; 94 ° С в течение 2 мин; затем 40 циклов 94 ° C в течение 15 секунд, 59 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 1 минуты; затем 72 ° C в течение 2 мин.

Клетки ES кролика индуцировали к дифференцировке in vitro путем их культивирования в виде агрегатов в суспензии с последующим повторным прикреплением. ES-клетки диссоциировали и культивировали в чашках для неприлипающих суспензий (Corning) в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Gibco) с 10% FCS.Через 7 дней агрегаты клеток, напоминающие эмбриоидные тельца, переносили в покрытые 0,1% желатином 6-луночные планшеты и культивировали еще 10 дней.

ES Генерация химеры

От восьми до десяти клеток линии rbES-1 микроинъектировали in vivo эмбрионам-реципиентам на 8-клеточной стадии породы Черная Аляска с помощью микроманипулятора Эппендорфа и переносили для вынашивания беременных реципиентов с гормональным примированием (100 МЕ эХГ и 80 МЕ ХГЧ, 72 часа спустя). Кролики родились естественным путем.

Выделение и характеристика мультипотентных стволовых клеток

МСК выделяли из костей ног молодого кролика-самца Alicia / Basilea (Ali / Bas) промыванием средой Advanced DMEM (Gibco) с добавлением 10% FCS. Аспират фильтровали через сетчатый фильтр для клеток 40 мкм и предварительно культивировали в среде MSC, состоящей из Advanced DMEM с добавлением 10% FCS, 0,1 мМ заменимых аминокислот (PAA Laboratories), 2 мМ GlutaMAX (Gibco), 5 нг / мл FGF2, 100 мкг. / мл пенициллин-стрептомицин и 100 мкг / мл амфотерицина B (PAA Laboratories).Неприкрепленные клетки удаляли на следующий день, и прикрепленные клетки культивировали еще 3 дня. Обычное культивирование проводили на среде MSC без антибиотиков; клеточные слои диссоциировали для пассажа с использованием Accutase.

МСК кроликов оценивали по их способности давать начало остеогенным, адипогенным и хондрогенным линиям. Остеогенная дифференцировка индуцировалась в 70% конфлюэнтных монослоях в среде MSC с использованием 100 нМ дексаметазона, 10 мМ β-глицерофосфата и 50 мкг / мл L-аскорбата.Через 14 дней клетки фиксировали, инкубировали в 5% растворе нитрата серебра и облучали ультрафиолетом; кальциевые соли визуализировались с помощью 5% тиосульфата натрия. Адипогенная дифференцировка индуцировалась в 80% конфлюэнтных монослоях в среде MSC с 0,5 мкг / мл изобутилметилксантина, 10 мкг / мл добавки ITS + 1 жидкой среды, 100 мкМ индометацина (Fluka) и 1 мМ дексаметазона. Через 21 день клетки фиксировали и окрашивали Oil Red O. Хондрогенную дифференцировку индуцировали ростом в суспензии в среде MSC без FGF2, с 10 нг / мл трансформирующего фактора роста бета-1 (TGFB1; PromoKine).Через 21 день клетки промывали, осаждали и расщепляли в течение ночи 1 мг / мл папаина. Содержание гликозаминогликанов определяли количественно с помощью анализа диметилметиленового синего с использованием акульего хондроитин-6 сульфата в качестве стандарта и нормализовали по общему содержанию ДНК с помощью анализа PicoGreen.

Получение фибробластов от клонированных животных

Фибробласты получали из образцов кожи ушей трансгенных кроликов, клонированных EGFP-MSC, которые умерли вскоре после рождения. Хрящ был удален, образцы кожи были мелко нарезаны и обработаны 0.25% (мас. / Об.) Трипсина, 1 мМ этилендиаминтерауксусной кислоты в PBS в течение 30 мин при 37 ° C. Переваренные клетки и ткани высевали в колбы для культивирования клеток емкостью 25 см ² , содержащие DMEM / F12 с добавлением 10% FCS, и культивировали в инкубаторе с 5% CO ₂ при 37 ° C. После достижения слияния 70–80% монослои первичных клеток веретенообразной морфологии дезагрегировали для дальнейшего культивирования. Фибробласты криоконсервировали в пассажах 1-3 для дальнейшего использования.

Трансфекция

МСК кролика и ES-клетки (линия 5) трансфицировали одной из двух репортерных конструкций: PGK-EGFP (промотор фосфоглицераткиназы мыши, управляющий EGFP) или CAG-mCherry (ранний энхансер CMV / промотор β-актина цыпленка, управляющий экспрессией красного флуоресцентного белка mCherry. белок).Клетки собирали с помощью Accutase, подсчитывали, осаждали центрифугированием при 340 × g в течение 5 минут и ресуспендировали в 400 мкл буфера для электропорации при 1 × 10 ⁶ клеток / мл. Добавляли плазмидную ДНК, смесь переносили в кювету для электропорации (ширина зазора 4 мм) и электропорацию проводили с использованием мультипоратора (Eppendorf) с одним импульсом при 1200 В в течение 85 мкс (для МСК) или 250 В в течение 85 мкс ( для ячеек rbES). Клетки инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре и переносили во флаконы Т-75, содержащие среду MSC, или флаконы Т-25, содержащие среду для клеток ES.Отбор с использованием 600 и 150 мкг / мл G418 (для клеток MSC и ES соответственно) применяли через 48 часов после трансфекции (рис. 1).

Рис. 1

Трансфекция кроличьих МСК и ES клеток. МСК трансфицировали конструкциями PGK-GFP ( A ) и mCherry ( B ). C ) линия 5 клеток rbES, трансфицированная PGK-EGFP. Исходное увеличение × 100 ( A — C ).

Рис. 1

Трансфекция кроличьих МСК и ES клеток.МСК трансфицировали конструкциями PGK-GFP ( A ) и mCherry ( B ). C ) линия 5 клеток rbES, трансфицированная PGK-EGFP. Исходное увеличение × 100 ( A — C ).

Передача ядерных материалов

Ооциты были получены от половозрелых кроликов Зика (примерно 3,0 кг и возраст 5–6 мес.). Самок кроликов суперовулировали путем инъекции 100 МЕ эХГ внутримышечно и 100 МЕ ХГЧ внутривенно через 96 часов. Зрелые ооциты вымывали из яйцеводов через 15–16 ч после инъекции ХГЧ в теплом PBS с добавлением 4 мг / мл бычьего сывороточного альбумина.Клетки кумулюса удаляли осторожным пипетированием пипеткой с маленьким отверстием после обработки ооцитов 5 мг / мл гиалуронидазы в среде M199 с добавлением 10% FCS в течение 15 мин при 38,5 ° C. Обнаженные ооциты обрабатывали 0,6 мкг / мл демеколцина между 40 мин и 2 часами [29]. Образовавшееся выступание метафазы II с небольшой подстилающей цитоплазмой было удалено в M199 с добавлением 7,5 мкг / мл цитохалазина B (CB) и 0,6 мкг / мл демеколцина с помощью пипетки для энуклеации. Энуклеированные ооциты хранились в M199 и позже использовались в качестве реципиентных цитопластов.

Донорские клетки культивировали в среде, содержащей пониженную сыворотку (0,5% FCS), в течение 3-5 дней перед переносом ядра. Прилипшие клетки собирали перевариванием Accutase, трижды промывали и суспендировали в среде M199 с добавлением 10% FCS. Индивидуальная клетка-донор ядра была введена под блестящую зону энуклеированного ооцита в M199. Комплексы кариопласт-цитопласт (KCC) были вручную выровнены в камере для слияния, состоящей из двух проволочных электродов на расстоянии 200 мкм друг от друга, покрыты средой для слияния Eppendorf, а затем слиты с помощью Eppendorf Multiporator (Гамбург, Германия) с использованием двойного постоянного тока 1.95 кВ / см в течение 25 мкс. После 30-минутной инкубации в M199 слитые KCC активировали теми же электрическими импульсами, что и для слияния, затем сразу же инкубировали в M199 с добавлением 1,9 мМ 6-диметиламинопурина и 7,5 мкг / мл CB (среда активации). Через 30 минут слитые эмбрионы снова обрабатывали теми же электрическими импульсами и культивировали в среде активации в течение еще 30 минут. После активации реконструированные эмбрионы были промыты, а затем культивированы в среде Menezo B2 (INRA), содержащей 2,5% FCS, в увлажненной атмосфере 5% CO ₂ на воздухе при 38.5 ° С. Эмбрионы, предназначенные для переноса реципиентам, культивировали в течение ночи, в то время как те, которые использовались для оценки развития in vitro, культивировали до 5 дней, при этом стадии эмбриона оценивались визуальным наблюдением.

Перенос эмбрионов проводили лапароскопически по методике Безенфельдера и Брема [30]. Эмбрионы на стадии от 4 до 10 клеток переносили через воронку в каждый яйцевод самок-реципиентов с псевдобеременностью, индуцированной инъекцией 80 МЕ ХГЧ через 24 ч после инъекции самок, используемых в качестве доноров ооцитов.Беременность определяли путем пальпации примерно через 2 недели после переноса эмбриона. Потомство родилось либо естественным путем, либо путем кесарева сечения.

Обнаружение флуоресценции EGFP и mCherry в клетках, клонированных эмбрионах и потомстве

Флуоресценцию

анализировали с помощью инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа (Axiovert 200M; Zeiss), снабженного соответствующими фильтрами (FITS для зеленого и G2A для красного). Цифровые изображения были получены с помощью объектива 20x и цветной CCD-камеры (AxioCam HR; Zeiss).Флуоресценцию GFP тестировали на коже клонированных кроликов с использованием эпифлуоресцентного света.

Генотипирование клонированных кроликов

Ali / Bas генотипирование клонированных кроликов, кроликов-реципиентов и донорских клеток проводили путем аллельной дискриминации с помощью ПЦР в реальном времени с помощью 5′-нуклеазного анализа (TaqMan) с использованием системы количественной ПЦР ABI 7500. Праймеры и зонды, использованные для аллеля Ali, были: Ali-forward (GCAGCAGTTCAACAGCACGAT), Ali-reverse (TTGTTGTGGACTTTGCACTTGAA), зонд Taqman MGB для аллеля wt (VIC-ATCGCGCACGAGGA-MGB) и зонд Taqman MGB для аллеля Ali ATCACGCACGAGGAC-MGB).Праймеры и зонды, использованные для аллеля Bas, были: Bas-forward (GGAGATGCCCACTGGTACCTAA), Bas-reverse (TGTTTCAGTTGTCAGCTGATCAG), зонд Taqman MGB для аллеля wt (VIC-CTCCTCAGGTGATCC-MGB) и зонд Taqman MGB для аллеля Bas CTCCTCAAGTGATCC-MGB).

Для проверки наличия гена EGFP была проведена ПЦР с 100 нг образцами геномной ДНК, которые были извлечены из ушей клонированных кроликов. Амплификацию проводили с использованием полимеразы GoTaq (Promega) со следующими праймерами: GFP-прямой (GGCCACAAGTTCAGCGTGTC) и GFP-обратный (GTCCATGCCGAGAGTGATCC).Тепловые параметры: 95 ° C в течение 5 мин; затем 35 циклов при 94 ° C в течение 30 секунд; 55 ° C в течение 30 секунд; 72 ° C в течение 1 мин; затем 72 ° C в течение 1 мин.

Результаты

Мы выделили и охарактеризовали плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки кролика и мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки и исследовали их пригодность для переноса ядра.

Выделение плюрипотентных стволовых клеток кролика и характеристика

Всего в культуру было взято 403 эмбриона кролика-альбиноса Зика, из которых было получено 257 жизнеспособных эксплантов.Было получено 72 клеточных линии с недифференцированной морфологией, которые дожили до пассажа 4, но на этой стадии многие линии дифференцировались и были потеряны. Тринадцать предполагаемых клеточных линий rbES продолжали пролиферировать до пассажа 10 и далее. Девять из них были охарактеризованы более подробно. Эти установленные кроличьи клеточные линии показали устойчивое самообновление, и некоторые линии были выращены до пассажа 40.

Сначала мы проанализировали экспрессию характерных маркеров ES-клеток. Все протестированные линии экспрессировали щелочную фосфатазу (см. Дополнительный рис.S1). Была создана серия анализов RT-PCR для обнаружения экспрессии POU5F1, REX1, NANOG, TERC, NODAL, FOXD3, DPPA5, и BMP4 . Анализ линий 1, 5, 6, 8 и 9 rbES показал, что все экспрессировали каждый из этих генов (см. Дополнительный рис. S2). Экспрессия белка POU5F1 также была подтверждена иммунодетекцией. Однако ни один из маркеров клеточной поверхности (SSEA-1, SSEA-4, TRA-1–60 и TRA-1–81) не был обнаружен, что согласуется с результатами, полученными Fang et al. [16] (см. Дополнительный рис.S3), хотя очевидное отсутствие этих антигенов могло быть связано с отсутствием межвидовой реактивности с используемыми антителами. Параллельное иммуноокрашивание ES-клетками мыши и клетками эмбриональной карциномы человека выявило SSEA-1, SSEA-4, TRA-1–60 и TRA-81, подтверждая, что анализ был функциональным (см. Дополнительный рисунок S3).

Затем проверяли плюрипотентный характер клеточных линий rbES путем образования эмбриоидных телец суспензионной культурой в отсутствие LIF и FGF2 с последующим повторным посевом.Наблюдалась дифференцировка в различные типы клеток, включая участки пульсирующих кардиомиоцитов после дифференцировки линии rbES-5 (см. Дополнительный фильм и рис. 2).

Рис. 2

Стоп-кадр из Дополнительного фильма. Биение кардиомиоцитов образовано путем дифференцировки линии rbES-5. Оригинальное увеличение × 100.

Рис. 2

Стоп-кадр из Дополнительного фильма. Биение кардиомиоцитов образовано дифференцировкой линии rbES-5.Оригинальное увеличение × 100.

Окончательный тест для любой нечеловеческой линии ES-клеток — это способность вносить свой вклад в развитие химерных животных. Сначала был проведен анализ кариотипа для выявления каких-либо грубых хромосомных аномалий со стороны ES-клеток. Все протестированные линии rbES показали нормальный кариотип из 44 хромосом (> 70% проанализированных клеток). Клетки линии (albino) rbES-1 микроинъектировали в эмбрионы кроликов породы Черный Аляска (фиг. 3А), чтобы можно было распознать вклад ES по цвету шерсти.Пробные эксперименты показали, что введение клеток rbES в бластоцисты кролика in vivo было механически затруднено из-за толстого слоя мукопротеинов или муколеммы, окружающего эмбрион (рис. 3B). Поэтому мы вводили клетки rbES в эмбрионы, полученные in vivo на стадии 4-8 клеток, когда муколемма становится относительно тонкой (рис. 3С). У мышей инъекция или агрегация ES клеток с эмбрионами на стадии прекомпакции является очень успешным средством получения вклада ES в химерных животных [31].Мы выполнили инъекции 198 эмбрионов, перенесли 7 реципиентов и получили в общей сложности 20 живорожденных и 1 мертворожденное потомство. У двадцати особей был только черный окрас шерсти, а у одного живорожденного потомства были явные признаки химеризма окраса шерсти (рис. 3D). Химера была морфологически мужской, но линия ES, использованная для инъекции, была женской. ПЦР-амплификация гена SRY из волосяных фолликулов, взятых из белых и черных пятен, показала, что белые пятна были женскими, а черные — мужскими (см. Дополнительный рис.S4). Однако химерное животное было слабым и умерло через 60 дней после рождения. Следовательно, наследование по зародышевой линии не может быть проверено. Тем не менее, насколько нам известно, это первое сообщение о кроличьей химере, производной от ES.

Рис. 3

A ) Черный кролик Аляски. B ) Инъекция ES-клеток в бластоцисту кролика; обратите внимание на толстую муколемму. C ) Инъекция ES-клеток в 8-клеточный эмбрион. D ) Химера клеток Black Alaska / albino Zika ES.Исходное увеличение × 200 ( B ) и × 320 ( C ).

Рис. 3

A ) Черный кролик Аляски. B ) Инъекция ES-клеток в бластоцисту кролика; обратите внимание на толстую муколемму. C ) Инъекция ES-клеток в 8-клеточный эмбрион. D ) Химера клеток Black Alaska / albino Zika ES. Исходное увеличение × 200 ( B ) и × 320 ( C ).

Выделение и характеристика мультипотентных стволовых клеток кроликов

МСК были выделены из костного мозга кролика-самца Ali / Bas и исследованы с помощью стандартных анализов для определения характерной дифференциации в костные, хрящевые и жировые клетки (рис.4 и 5). Через 3 недели после индукции остеогенеза МСК сильно окрашивались ализариновым красным, что указывает на отложение фосфата кальция (рис. 4, A и B). Адипогенная дифференцировка приводила к тому, что большинство клеток содержало многочисленные липидные капли, что визуализировалось с помощью окрашивания Oil Red O (рис. 4, C и D). Хондрогенная индукция приводила к образованию характерных компактных хрящевых трехмерных гранул. Гранулы показали повышенное содержание как сульфатированных гликозамигликанов, так и ДНК, что указывает на то, что МСК образуют ткань, характерную для хряща (рис.5).

Рис. 4

Остеогенез и адипогенез. Типичные микрофотографии кроличьих МСК, выращенных в стандартных условиях ( A , C ), в остеогенной среде, окрашенной красителем ализариновым красным ( B ), и в адипогенной среде, окрашенной Oil Red O ( D ). Исходное увеличение × 100 ( A — D ).

Рис. 4

Остеогенез и адипогенез. Типичные микрофотографии кроличьих МСК, выращенных в стандартных условиях ( A , C ), в остеогенной среде, окрашенной красителем ализариновым красным ( B ), и в адипогенной среде, окрашенной Oil Red O ( D ).Исходное увеличение × 100 ( A — D ).

Рис. 5

Хондрогенез. Доля гликозаминогликанов (CAG) по отношению к общему количеству ДНК.

Рис. 5

Хондрогенез. Доля гликозаминогликанов (CAG) по отношению к общему количеству ДНК.

Перенос ядра с использованием плюрипотентных и мультипотентных стволовых клеток кролика

Rabbit ES линий 1, 5, 6, 9, 19 и 20 были оценены на предмет компетентности в отношении передачи ядер.Результаты для каждой линии были сходными и объединены в таблице 1. Примерно четверть реконструированных эмбрионов завершили развитие до стадии бластоцисты in vitro. Однако более длительное развитие in vivo было менее обнадеживающим (таблица 2). Хотя 12 из 22 получателей переноса эмбрионов забеременели, ни одна из них не привела к рождению живых кроликов.

Таблица 1

Развитие in vitro эмбрионов, реконструированных с использованием ES-клеток, MSC-клеток и стабильных трансфицированных пулов MSC.

Донорские клетки .	с предохранителем .	Раскол .	Бластоцисты а .
RbES	1858/2181 (85%)	1239/1821 (68%)	243/1054 (23%)
MSC	793/8448		9025% 698/786 (89%)	48/128 (38%)
GFP-MSC	412/444 (93%)	377/409 (92%)	97/178 (55%)

Донорские клетки .	с предохранителем .	Раскол .	Бластоцисты а .
RbES	1858/2181 (85%)	1239/1821 (68%)	243/1054 (23%)
MSC	793/8448		9025% 698/786 (89%)	48/128 (38%)
GFP-MSC	412/444 (93%)	377/409 (92%)	97/178 (55%)

Таблица 1

Развитие in vitro эмбрионов, реконструированных с использованием ES-клеток, MSC-клеток и стабильных трансфицированных пулов MSC.

Донорские клетки .	с предохранителем .	Раскол .	Бластоцисты а .
RbES	1858/2181 (85%)	1239/1821 (68%)	243/1054 (23%)
MSC	793/8448		9025% 698/786 (89%)	48/128 (38%)
GFP-MSC	412/444 (93%)	377/409 (92%)	97/178 (55%)

Донорские клетки .	с предохранителем .	Раскол .	Бластоцисты а .
RbES	1858/2181 (85%)	1239/1821 (68%)	243/1054 (23%)
MSC	793/8448	9025%	698/786 (89%)	48/128 (38%)
GFP-MSC	412/444 (93%)	377/409 (92%)	97/178 (55%)

Таблица 2

Развитие in vivo эмбрионов, реконструированных с использованием ES-клеток, MSC-клеток и стабильных трансфицированных пулов MSC.

Донорские клетки .	Перенесенные эмбрионы / реципиенты .	Беременные реципиенты .	Кролики родились а .
Rb ES	607/23	12/22	0
MSC	483/13	9/13	10 (2%)
MSC	216/8	4/8	8 (4%)

Донорские клетки .	Перенесенные эмбрионы / реципиенты .	Беременные реципиенты .	Кролики родились а .
Rb ES	607/23	12/22	0
MSC	483/13	9/13	10 (2%)
MSC	216/8	4/8	8 (4%)

Таблица 2

Развитие in vivo эмбрионов, реконструированных с использованием ES-клеток, MSC-клеток и стабильных трансфецированных пулов MSC.

Донорские клетки .	Перенесенные эмбрионы / реципиенты .	Беременные реципиенты .	Кролики родились а .
Rb ES	607/23	12/22	0
MSC	483/13	9/13	10 (2%)
MSC	216/8	4/8	8 (4%)

Донорские клетки .	Перенесенные эмбрионы / реципиенты .	Беременные реципиенты .	Кролики родились а .
Rb ES	607/23	12/22	0
MSC	483/13	9/13	10 (2%)
MSC	216/8	4/8	8 (4%)

Оценка способности МСК кролика поддерживать развитие in vitro и in vivo путем переноса ядра была более успешной, как показано в таблицах 1 и 2.Большая часть эмбрионов, происходящих из МСК, подверглась дроблению, и более одной трети превратились в бластоцисты. Перенос эмбрионов, полученных из МСК, привел к девяти беременностям. Два реципиента родили двух мертворожденных и восемь живых потомков (таблица 2). Из них два кролика прожили более 7 дней и один 3 месяца, но это животное пришлось усыпить из-за тяжелой бактериальной инфекции.

Использование генетически маркированного штамма Ali / Bas позволило однозначно идентифицировать потомство, происходящее от МСК.Аллельная дискриминация с помощью количественного анализа ПЦР показала, что донорские клетки и клонированные кролики были Ali / Bas по происхождению, а кролики-реципиенты — нет.

Ядерный перенос с использованием генетически модифицированных МСК

Эти результаты заставили нас сосредоточить последующие эксперименты на МСК, а не на ES клетках. МСК стабильно трансфицировали конструкцией PGK-EGFP или CAG-mCherry. Пулы стабильных трансфектантов оценивали на способность к переносу ядра, сначала культивированием in vitro на бластоцисту, а затем in vivo после переноса эмбриона.Культура реконструированных эмбрионов показала высокую долю дробления, аналогичную нетрансфицированным МСК, и примерно половина реконструированных эмбрионов превратилась в бластоцисты.

Мы исследовали, является ли угасание и реактивация экспрессии EGFP и mCherry визуальным индикатором успешной и своевременной активации эмбрионального генома в реконструированных эмбрионах и коррелирует ли с потенциалом развития. Мы обнаружили, что флуоресценция исчезла через 1-2 часа после реконструкции эмбриона и снова стала обнаруживаться у части эмбрионов на стадии от 8 до 16 клеток через 42-48 часов после переноса ядра (рис.6). На стадиях морулы и бластоцисты доля EGFP-положительных эмбрионов была значительно выше, чем для mCherry-положительных эмбрионов (рис. 6 и 7 и таблица 3). Это было несколько неожиданно, потому что экспрессия конструкции CAG-mCherry в пулах трансфицированных MSC была по крайней мере такой же сильной, как экспрессия, полученная с PGK-EGFP. Однако не было очевидной корреляции между экспрессией любого репортерного гена и последующим развитием.

Таблица 3 Экспрессия

GFP или mCherry в эмбрионах с переносом ядра.

Донорские клетки .	Раскол .	GFP- или mCherry-позитивные эмбрионы 2-го дня a .	GFP- или mCherry-позитивные эмбрионы 3-го дня b .	GFP- или mCherry-положительные бластоцисты .
GFP-MSC	123/144 (85%)	17/108 (16%)	57/81 (70%)	53/72 (74%)
mCherry -MSC	125/133 (94%)	12/94 (13%)	17/69 (25%)	15/60 (25%)

Донорские клетки .	Раскол .	GFP- или mCherry-позитивные эмбрионы 2-го дня a .	GFP- или mCherry-позитивные эмбрионы 3-го дня b .	GFP- или mCherry-положительные бластоцисты .
GFP-MSC	123/144 (85%)	17/108 (16%)	57/81 (70%)	53/72 (74%)
mCherry -MSC	125/133 (94%)	12/94 (13%)	17/69 (25%)	15/60 (25%)

Таблица 3

Выражение GFP или mCherry в эмбрионах с переносом ядра.

Донорские клетки .	Раскол .	GFP- или mCherry-позитивные эмбрионы 2-го дня a .	GFP- или mCherry-позитивные эмбрионы 3-го дня b .	GFP- или mCherry-положительные бластоцисты .
GFP-MSC	123/144 (85%)	17/108 (16%)	57/81 (70%)	53/72 (74%)
mCherry -MSC	125/133 (94%)	12/94 (13%)	17/69 (25%)	15/60 (25%)

Донорские клетки .	Раскол .	GFP- или mCherry-позитивные эмбрионы 2-го дня a .	GFP- или mCherry-позитивные эмбрионы 3-го дня b .	GFP- или mCherry-положительные бластоцисты .
GFP-MSC	123/144 (85%)	17/108 (16%)	57/81 (70%)	53/72 (74%)
mCherry -MSC	125/133 (94%)	12/94 (13%)	17/69 (25%)	15/60 (25%)

Рис.6

Экспрессия

GFP в MSC и в клонированных эмбрионах GFP-MSC. Исходное увеличение × 200 (MSC) и × 100 (эмбрионы).

Рис. 6

Экспрессия

GFP в MSC и в клонированных эмбрионах GFP-MSC. Исходное увеличение × 200 (MSC) и × 100 (эмбрионы).

Рис. 7

Экспрессия

mCherry в бластоцитах, клонированных mCherry-MSC. Оригинальное увеличение × 100.

Рис. 7

Экспрессия mCherry в бластоцитах, клонированных mCherry-MSC. Оригинальное увеличение × 100.

Для получения трансгенных кроликов перенос ядра осуществляли с помощью МСК, экспрессирующих EGFP. Это привело к четырем беременностям, одна из которых продолжилась до срока. Самка-реципиент родила двух мертворожденных и шесть живых потомков (таблица 2). Трое из живых потомков умерли вскоре после рождения, двое выжили в течение 2–3 дней, а один — 17 дней. Как было показано ранее, генетический анализ подтвердил, что клонированные клетки-потомки и донорские клетки были Ali / Bas по происхождению и трансгенными по PGK-EGFP, в то время как реципиенты не были (рис.8).

Рис. 8

Геномный анализ кроликов, полученных путем переноса ядра с использованием трансгенных МСК EGFP в качестве донорских клеток. Присутствие трансгена EGFP у клонированных кроликов подтверждали амплификацией ПЦР из геномной ДНК. Дорожка 1, маркерная ДНК длиной 100 п.н .; дорожки 2–5, амплифицированный продукт EGFP от клонированных кроликов 1–4, соответственно; дорожка 6, отрицательный контроль.

Рис. 8

Геномный анализ кроликов, полученных путем переноса ядра с использованием трансгенных МСК EGFP в качестве донорских клеток.Присутствие трансгена EGFP у клонированных кроликов подтверждали амплификацией ПЦР из геномной ДНК. Дорожка 1, маркерная ДНК длиной 100 п.н .; дорожки 2–5, амплифицированный продукт EGFP от клонированных кроликов 1–4, соответственно; дорожка 6, отрицательный контроль.

Второй раунд переноса ядер с использованием фибробластов от клонированных кроликов

Большинство трансгенных клонированных кроликов погибли в течение нескольких дней после рождения. Чтобы проверить, может ли второй раунд репрограммирования спасти потенциально ценный генотип и, возможно, повысить жизнеспособность, мы выполнили второй раунд переноса ядра с использованием недавно выделенных фибробластов от двух трансгенных кроликов EGFP, которые умерли вскоре после рождения (F-GFP-MSC-A и -B).Результаты переноса ядра приведены в таблицах 4 и 5. Доля эмбрионов, которые отщепились и перешли на стадию бластоцисты in vitro, была аналогична той, что наблюдалась для эмбрионов, полученных из МСК. Однако, хотя в результате переноса эмбрионов было зафиксировано 10 беременностей, только у двух реципиентов наступили сроки. Из них два мертвых кролика были доставлены путем кесарева сечения (Таблица 5).

Таблица 4

Развитие in vitro эмбрионов, реконструированных с использованием фибробластов от клонированных трансгенных кроликов.

Донорские клетки .	с предохранителем .	Раскол .	Бластоцисты а .
F-GFP-MSC-A	341/377 (90%)	274/341 (80%)	39/75 (52%)
F-GFP-MSC- B	566/607 (93%)	487/409 (86%)	27/76 (36%)

Донорские клетки .	с предохранителем .	Раскол .	Бластоцисты а .
F-GFP-MSC-A	341/377 (90%)	274/341 (80%)	39/75 (52%)
F-GFP-MSC- B	566/607 (93%)	487/409 (86%)	27/76 (36%)

Таблица 4

Развитие in vitro эмбрионов, реконструированных с использованием фибробластов от клонированных трансгенных кроликов.

Донорские клетки .	с предохранителем .	Раскол .	Бластоцисты а .
F-GFP-MSC-A	341/377 (90%)	274/341 (80%)	39/75 (52%)
F-GFP-MSC- B	566/607 (93%)	487/409 (86%)	27/76 (36%)

Донорские клетки .	с предохранителем .	Раскол .	Бластоцисты а .
F-GFP-MSC-A	341/377 (90%)	274/341 (80%)	39/75 (52%)
F-GFP-MSC- В	566/607 (93%)	487/409 (86%)	27/76 (36%)

Таблица 5

Развитие in vivo эмбрионов, реконструированных с использованием фибробластов от клонированных трансгенных кроликов.

Донорские клетки .	Перенесенные эмбрионы / реципиенты .	Беременные реципиенты .	Кролики родились а .
F-GFP-MSC-A	188/6	3/6	2 (1%)
F-GFP-MSC-B	365/8	7 / 8	0

Донорские клетки .	Перенесенные эмбрионы / реципиенты .	Беременные реципиенты .	Кролики родились а .
F-GFP-MSC-A	188/6	3/6	2 (1%)
F-GFP-MSC-B	365/8	7 / 8	0

Таблица 5

Развитие in vivo эмбрионов, реконструированных с использованием фибробластов от клонированных трансгенных кроликов.

Донорские клетки .	Перенесенные эмбрионы / реципиенты .	Беременные реципиенты .	Кролики родились а .
F-GFP-MSC-A	188/6	3/6	2 (1%)
F-GFP-MSC-B	365/8	7 / 8	0

Донорские клетки .	Перенесенные эмбрионы / реципиенты .	Беременные реципиенты .	Кролики родились а .
F-GFP-MSC-A	188/6	3/6	2 (1%)
F-GFP-MSC-B	365/8	7 / 8	0

Примечательно, что хотя флуоресценция GFP была очевидна в исходных ядерных донорных клетках EGFP-MSC, она не наблюдалась в коже клонированных кроликов в первом раунде, в полученных из них фибробластах, в повторно клонированных эмбрионах в vitro, ни в мертвых повторно клонированных потомках.Однако присутствие гена EGFP в фибробластах и ​​потомстве было подтверждено анализом ПЦР.

Обсуждение

Получение ген-нацеленных и трансгенных кроликов клеточно-опосредованным трансгенезом будет оставаться трудным, пока не будет решена проблема низкой жизнеспособности после переноса ядра. Мы исследовали плюрипотентные и мультипотентные типы клеток-кандидатов в качестве доноров ядра. Мы получили предполагаемые эмбриональные стволовые клетки кролика, продемонстрировали in vitro маркеры плюрипотентности и сообщили о первой живорожденной химере кролика.Эти клетки исследовали на их способность поддерживать развитие после переноса ядра и сравнивали с МСК. МСК были дополнительно исследованы как средство создания трансгенных кроликов, и мы сообщаем здесь о первых живых клонированных кроликах из генетически измененных МСК. Мы также исследовали серийную передачу ядер как средство спасения мертвых животных и повышения их жизнеспособности.

Кролики были получены путем переноса ядер из ряда культивируемых типов клеток, но эффективность клонирования неизменно очень низкая.Хотя большая часть (до 70–90%) реконструированных эмбрионов может развиться до бластоцисты [27, В. Захарченко, неопубликованные результаты], лишь немногие из них дают живое потомство и еще меньше доживают до зрелости. Собранные опубликованные данные показывают, что из 42 клонированных кроликов, живущих при рождении, только 17 достигли половой зрелости [16, 24–27, 32]. О наибольшем количестве клонированных кроликов, доживших до взрослого возраста (восемь), недавно сообщили Meng et al. [27] с использованием свежих некультивируемых клеток кумулюса. Однако клетки кумулюса плохо пролиферируют в культуре [33] и практически не используются в клеточно-опосредованном трансгенезе.

Было высказано предположение, что клетки с высокой степенью пластичности развития могут быть лучшими донорами ядер, чем более дифференцированные типы клеток [34]. Однако выделение и размножение плюрипотентных стволовых клеток, таких как клетки ES, оказалось трудным для большинства млекопитающих, кроме мышей, и было проведено мало экспериментов с их использованием в качестве доноров ядра. Работа с мышиными ES-клетками показала, что, хотя начальное развитие лучше у эмбрионов, происходящих из дифференцированных донорских клеток, более высокая фракция ES-происходящих эмбрионов развивается до срока [35].

Доступные данные о МСК как ядерных донорах неоднозначны и показывают различия между видами млекопитающих. MSC были впервые использованы для переноса ядер у крупного рогатого скота Kato et al. [20], которые предположили, что эмбрионы, полученные из МСК, не обладают более высоким потенциалом развития, чем эмбрионы, полученные из других клеток. Однако набор данных был небольшим и не включал прямого сравнения с другими типами клеток. Последующие исследования МСК у разных видов дали противоположные результаты. Сходные скорости развития бластоцисты с использованием доноров МСК и взрослых фибробластов были описаны у крупного рогатого скота и свиней Colleoni et al.[21] и у свиней — по Bosch et al. [22]. Faast et al. [23] сообщили о почти двукратном увеличении выхода бластоцист при использовании MSC свиней, чем взрослых фибробластов, полученных от того же животного. Другие исследования на свиньях также описали более высокую скорость развития бластоцисты с МСК костного мозга, чем фибробласты плода [36, 37]. Эти результаты были подтверждены анализом экспрессии гена плюрипотентности ( POU5F1, STAT3, NANOG ), метилирования ДНК ( DNMT1, DNMT3A ), деацетилирования гистонов ( HDAC2 ), передачи сигналов фактора роста и импринтинга ( IGF2, IGF2R ). и апоптоз ( BAX, BCL2 ), который показал, что клонированные эмбрионы свиньи, полученные из MSC, больше напоминают нормальные эмбрионы in vivo, чем клонированные эмбрионы, полученные из фетальных фибробластов [37].Наши собственные результаты (Захарченко и др., Неопубликованные результаты) также показывают, что свиньи МСК эффективно поддерживают таргетинг генов и перенос ядер.

Сначала мы оценили предполагаемые кроличьи ES-клетки и МСК на плюрипотентность или мультипотентность, а затем сравнили их способность поддерживать развитие эмбриона. Наши результаты с ES-клетками кролика разительно отличаются от результатов с ES-клетками мыши. Мы провели почти 2000 реконструкций эмбрионов с использованием шести независимо полученных линий rbES. Развитие до стадии бластоцисты было хуже, чем при использовании МСК кролика, и ни один из них не завершился беременностью.Наши линии ES были явно плюрипотентными при анализе in vitro, а анализ кариотипа не выявил серьезных отклонений. Тем не менее, возможно, присутствовал какой-то тонкий дефект. Химера была получена на одной линии, но эффективность получения химеры была низкой. Это может быть связано с техническими факторами, связанными с микроинъекцией, но также возможно, что наши плюрипотентные клеточные линии не являются дефинитивными ES-клетками. Недавно было высказано предположение, что многие изоляты человеческих ES-клеток на самом деле могут быть плюрипотентными стволовыми клетками эпибласта [38, 39].

Перенос ядра МСК кролика выполнялся с помощью той же процедуры и привел к более высокой доле клонированных эмбрионов, развивающихся до бластоцисты и множественных живорождений. Наши исследования эффективности переноса ядра с использованием генетически модифицированных МСК были особенно информативными. Очевидно, что манипуляции in vitro, такие как трансфекция ДНК, отбор лекарств и длительное культивирование, несут риск генетических или эпигенетических дефектов. Ранее мы обнаружили, что трансфицированные и отобранные фибробласты крупного рогатого скота поддерживают более низкую скорость развития эмбриона, чем изогенные нетрансфицированные фибробласты [40].Поэтому было очень обнадеживающим то, что трансфицированные МСК поддерживали развитие in vitro и vivo, по крайней мере, так же, как неманипулированные клетки, поддерживая их дальнейшее использование для нацеливания на гены. Насколько нам известно. это наибольшее количество (т. е. 18) кроликов, полученных путем переноса ядра с использованием долгоживущих культивированных клеток. Однако очевидно, что для увеличения выживаемости в первые несколько недель жизни необходимы дальнейшие улучшения.

Последовательный перенос ядер или повторное клонирование потенциально предлагает средства повышения жизнеспособности клонированных животных за счет проведения второго раунда перепрограммирования.Было проведено несколько исследований с использованием клеток, полученных из клонированных эмбрионов, плодов или постнатальных животных [41–45]. Ранее мы показали на крупном рогатом скоте, что второй раунд переноса ядра с использованием трансгенных фибробластов плода улучшил развитие бластоцисты [46]. Также сообщалось, что эффективность переноса ядра может поддерживаться в течение двух и трех раундов переноса ядра с использованием фетальных клеток крупного рогатого скота [4], в то время как другие исследователи описывают прогрессирующее снижение по сравнению с клональными поколениями, используя взрослые клетки крупного рогатого скота [47].Интересно, что недавно появилось сообщение об использовании ингибитора гистондеацетилазы для получения 15 последовательных поколений повторно клонированных мышей без снижения вероятности успеха, предполагая, что клонирование животных в принципе может повторяться бесконечно [48].

Мы проверили, является ли повторное клонирование полезным средством сохранения и размножения генетически модифицированного потомства кроликов с использованием постнатальных фибробластов. Эти клетки культивировали лишь короткое время по сравнению с трансфицированными МСК, используемыми в первом раунде переноса ядра.Общая эффективность повторного клонирования с точки зрения бластоцист и беременности до срока была сопоставима с первым раундом переноса ядра с использованием МСК, хотя живых кроликов получено не было. Потребуются дальнейшие эксперименты, чтобы определить, существует ли реальная разница в эффективности клонирования фибробластов и МСК.

Изучению многих факторов, влияющих на успешность переноса ядра, было бы очень полезно, если бы можно было получить некоторые ранние признаки жизнеспособности реконструированных эмбрионов.Ожидается, что большая часть экспрессии генов в перенесенном ядре прекратится сразу после переноса ядра и восстановится во время активации эмбрионального генома, которая у кроликов находится на стадии от 8 до 16 клеток [49]. Это также должно относиться к трансгенам, таким как PGK-EGFP или CAG-mCherry, и они могут обеспечить визуальный индикатор успешной и своевременной активации эмбрионального генома в реконструированных эмбрионах. Мы обнаружили, что экспрессия генов флуоресцентных маркеров действительно подавлялась после переноса ядра, снова становясь обнаруживаемой на стадии от 8 до 16 клеток.Однако были сообщения о более ранней экспрессии репортерных генов [50–53]. К сожалению, мы не наблюдали четкой корреляции между экспрессией флуоресцентного репортера и жизнеспособностью эмбриона. Не каждый эмбрион хорошего качества был положительным на EGFP или mCherry, и не каждый эмбрион, который развился дальше до бластоцисты, демонстрировал флуоресценцию. Мы также наблюдали, что реактивация репортерного трансгена происходила чаще, когда он находился под контролем промотора PGK, чем промотора CAG. Однако после второго раунда переноса ядра экспрессия трансгена PGK-EGFP также была потеряна, что указывает на эпигенетическое молчание.Наши результаты согласуются с выводами Bordignon et al. [54], которые описали, что у крупного рогатого скота заглушенный трансген не реактивировался после второго раунда переноса ядра. У свиней Kang et al. [55] сообщили, что ген EGFP не экспрессируется, хотя он находится под контролем промотора β-актина и упакован в активную структуру хроматина с высокоацетилированными гистонами h4 и h5.

Таким образом, плюрипотентные и мультипотентные клетки кролика были оценены на предмет их способности переносить ядро.Оба смогли установить беременность, но большие пометы клонированных животных были получены только с мультипотентными клетками MSC. Эти клетки можно легко генетически модифицировать без потери способности к переносу ядер, и поэтому они могут быть полезны для экспериментов по нацеливанию на гены. Однако требуются дальнейшие улучшения в передаче ядерных материалов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить докторов наук. Йозефу Платцеру и Ирмгард Тори за их помощь в генетическом подтверждении клонированных плодов кроликов и их потомков, Штеффену Лебницу за перенос эмбрионов кролика и животноводство, Мануэлю Глейзеру за анализ ES-клеток кролика и Маргрет Банвег за молекулярный анализ.Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов, который мог бы нанести ущерб беспристрастности этой научной работы.

Список литературы

1

Schnieke

AE

Тип

AJ

Ritchie

WA

Mycock

K

Скотт

AR

AE

AR

Ritchie

Campbell

KH

Трансгенные овцы человеческого фактора IX, полученные путем переноса ядер из трансфицированных фибробластов плода.

Наука

1997

;

278

:

2130

2133

,2

McCreath

KJ

Howcroft

J

Campbell

KH

Colman

A

Производство овец, нацеленных на ген, путем переноса ядра из культивируемых соматических клеток.

Природа

2000

;

405

:

1066

1069

.3

Denning

C

Burl

S

Ainslie

A

Bracken

J

Dinnyes

A

Fletcher

King

King

Ritchie

WA

Rollo

M

de Sousa

P

Travers

A

et al.

Делеция гена альфа (1,3) галактозилтрансферазы (GGTA1) и гена прионного белка (PrP) у овец.

Nat Biotechnol

2001

;

19

:

559

562

.4

Kuroiwa

Y

Kasinathan

P

Matsushita

H

Sathiyaselan

000

Sathiyaselan

Jullaselan

J Tomizuka

K

Ishida

I

Robl

JM

Последовательное нацеливание генов, кодирующих иммуноглобулин-мю и прионный белок у крупного рогатого скота.

Нат Генет

2004

;

36

:

775

780

, 5

Yu

G

Chen

J

Yu

H

Liu

S

u

J

Sha

H

Zhang

X

Wu

G

Xu

S

Cheng

G

Функциональное нарушение гена прионного белка у клонированных коз.

J Gen Virol

2006

;

87

:

1019

1027

,6

Dai

Y

Vaught

TD

Boone

J

Chen

SH

SH

J4000

Phelps

Monahan

JA

Jobst

PM

McCreath

KJ

Lamborn

AE

Cowell-Lucero

JL

Wells

KD

Направленное нарушение гена альфа-1,3-галактозилтрансферазы у клонированных свиней.

Nat Biotechnol

2002

;

20

:

251

255

,7

Lai

L

Kolber-Simonds

D

Park

KW

Cheong

HT

GS

Samuel

M

Bonk

A

Rieke

A

Day

BN

Murphy

CN

Carter

DB

et al.

Производство свиней с нокаутом по альфа-1,3-галактозилтрансферазе путем клонирования с переносом ядра.

Наука

2002

;

295

:

1089

1092

.8

Роджерс

CS

Хао

Y

Рохлина

T

Самуэль

M

Stol Petroff

E

Vermeer

DW

Kabel

AC

Yan

Z

Spate

L

Wax

D

и др.

Производство CFTR-нулевых и CFTR-DeltaF508 гетерозиготных свиней с помощью аденоассоциированного вируса нацеливания на гены и переноса ядер соматических клеток.

Дж. Клин Инвест

2008

;

118

:

1571

1577

.9

Rideout

WM

Wakayama

T

Wutz

A

Eggan Da

K

000 Json

Json

Json

Yanagimachi

R

Jaenisch

R

Получение мышей из ES-клеток дикого типа и клеток-мишеней путем ядерного клонирования.

Нат Генет

2000

;

24

:

109

110

.10

Eggan

K

Akutsu

H

Loring

J

Jackson-Grusby

L

III

Yanagimachi

R

Jaenisch

R

Гибридная энергия, разрастание плода и жизнеспособность мышей, полученные путем ядерного клонирования и комплементации тетраплоидных эмбрионов.

Proc Natl Acad Sci U S A

2001

;

98

:

6209

6214

.11

Вакаяма

T

Perry

AC

Zuccotti

M

Johnson

0005 мышей из энуклеированных ооцитов инъецировали ядра кумулюсных клеток.

Nature

1998

;

394

:

369

374

.12

Wakayama

T

Yanagimachi

R

Клонирование мышей-самцов из взрослых клеток кончика хвоста.

Nat Genet

1999

;

22

:

127

128

.13

Ogura

A

Inoue

K

Ogonuki

N

Noguchi

A

Takano

Takano

Takano

Takano

Suzuki

O

Lee

J

Ishino

F

Matsuda

J

Получение клонированных мышей-самцов из свежих, культивированных и криоконсервированных незрелых клеток Сертоли.

Биол Репрод

2000

;

62

:

1579

1584

.14

Бортвин

A

Eggan

K

Скалецкий

H

Akutsu

000

000

000

000

000

000

000

000

000

000

000

000

000

000

000 Страница

DC

Jaenisch

R

Неполная реактивация генов, связанных с Oct4, в эмбрионах мышей, клонированных из соматических ядер.

Девелопмент

2003

;

130

:

1673

1680

.15

Lin

W

Dent

SY

Функции гистон-модифицирующих ферментов в процессе развития.

Curr Opin Genet Dev

2006

;

16

:

137

142

.16

Клинок

ZF

Gai

H

Huang

YZ

Li

SG

SG

Chen

Chen 9000 Wu

L

Liu

A

Xu

P

Sheng

HZ

Линии эмбриональных стволовых клеток кролика, полученные из оплодотворенных, партеногенетических или соматических зародышей ядерного переноса.

Exp Cell Res

2006

;

312

:

3669

3682

,17

Ван

S

Тан

X

Niu

Y

Chen

H

Li

Li

Li 9000 Zhang

X

Hu

Z

Zhou

Q

Ji

W

Получение и характеристика эмбриональных стволовых клеток кролика.

стволовые клетки

2007

;

25

:

481

489

.18

Honda

A

Hirose

M

Inoue

K

Ogonuki

N

000

000 Shiki Хатори

M

Shimizu

N

Murata

T

Hirose

M

Katayama

K

Wakisaka

N

et al.

Стабильные линии эмбриональных стволовых клеток кроликов: потенциальные модели мелких животных для исследований на людях.

Reprod Biomed Online

2008

;

17

:

706

715

,19

Intawicha

P

Ou

YW

Lo

NW

Zhang

SC

000

Zhang

SC

000

Su

HL

Guu

HF

Chen

MJ

Lee

KH

Chiu

YT

Ju

JC

эмбриональных эмбриональных линий эмбрионов

JC

.

Клонирование стволовых клеток

2009

;

11

:

27

38

.20

Като

Y

Имабаяши

H

Mori

T

Tani

T

Migu4 Мацумото

M

Умедзава

A

Цунода

Y

Перенос ядра мезенхимальных стволовых клеток взрослого костного мозга: тотипотентность тканеспецифичных стволовых клеток от взрослого млекопитающего.

Биол Репрод

2004

;

70

:

415

418

,21

Colleoni

S

Donofrio

G

Lagutina

I

Duchi

Gall5000

000

R

Создание, дифференциация, электропорация, вирусная трансдукция и перенос ядра мезенхимальных стволовых клеток крупного рогатого скота и свиньи.

Клонирование стволовых клеток

2005

;

7

:

154

166

.22

Bosch

P

Pratt

SL

Stice

SL

Выделение, характеристика, модификация генов и ядерное перепрограммирование мезенхимальных стволовых клеток свиней.

Biol Reprod

2006

;

74

:

46

57

.23

Faast

R

Harrison

SJ

Beebe

LF

McIlfatrick

SM

9000 9000 RIM

9000 9000

SM

9000

Использование взрослых мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и крови, для переноса ядер соматических клеток свиньям.

Клонирование стволовых клеток

2006

;

8

:

166

173

.24

Chesné

P

Adenot

PG

Viglietta

C

Baratte

000 Rena

M

M

M

Клонированные кролики, полученные путем переноса ядер из взрослых соматических клеток.

Nat Biotechnol

2002

;

20

:

366

369

.25

Li

S

Chen

X

Fang

Z

Shi

J

Sheng

HZ

Кролики, полученные от фибробластов путем переноса ядер.

Репродукция

2006

;

131

:

1085

1090

.26

Ян

F

Hao

R

Kessler

B

Brem

G

Wolf 9000 Z0005

Клонирование соматических клеток кролика: влияние типа донорских клеток, статуса ацетилирования гистонов и комплементации химерного эмбриона.

Репродукция

2007

;

133

:

219

230

.27

Meng

Q

Polgar

Z

Liu

J

Dinnyes

A

живые клонированные клетки после клонирования rasatin лечение и котрансфер партеногенетических эмбрионов.

Клонирование стволовых клеток

2009

;

11

:

203

208

,28

Li

S

Guo

Y

Shi

J

Yin

C

000 L

9000 9000 Xing

Xing

Zhang

C

Liu

T

Li

Y

Li

H

Du

L

Chen

X

трансгенная экспрессия трансгенных флуоресцентных генов взрослые фибробласты, трансфицированные vitro.

Transgenic Res

2009

;

18

:

227

235

,29

Инь

X

Като

Y

Tsunoda

Y

Влияние процедур энуклеации и условий получения ядерных ооцитов кролика мужские фибробласты.

Репродукция

2002

;

124

:

41

47

.30

Besenfelder

U

Brem

G

Лапароскопический перенос эмбрионов кроликам.

J Reprod Fertil

1993

;

99

:

53

56

.31

Poueymirou

WT

Auerbach

W

Frendewey

D

Hickey

000

000

000

9000 J4000 J4000 J4000 J4000

9000 9000 J4000 J4000 J4000 Doré

AT

Stevens

S

Adams

NC

Dominguez

MG

Gale

NW

Yancopoulos

GD

Мыши поколения

F0, полностью полученные из нацеленных на ген эмбриональных стволовых клеток, что позволяет проводить немедленный фенотипический анализ.

Nat Biotechnol

2007

;

25

:

91

99

.32

Challah-Jacques

M

Chesné

P

Renard

JP

Получение клонированных кроликов с помощью соматического ядерного переноса.

Клонирование стволовых клеток

2003

;

5

:

295

299

.33

Dinnyes

A

Dai

Y

Barber

M

Liu

L

Xu

J

Zhou

000 клонированных

из фибробластов взрослого кролика: эффект активационной обработки и препарата донорских клеток.

Биол Репрод

2001

;

64

:

257

263

.34

Oback

B

Wells

D

Эффективность дифференциации, репрограммирования и клонирования донорских клеток: неуловимая или иллюзорная корреляция?

Mol Reprod Dev

2007

;

74

:

646

654

.35

Rideout

WM

III

Eggan

K

Jaenisch

R

Ядерное клонирование и эпигенетическое репрограммирование генома.

Наука

2001

;

293

:

1093

1098

0,36

Кумар

BM

Джин

HF

Ким

JG

Ок

S Choe

SY

Rho

GJ

Дифференциальные паттерны экспрессии генов в эмбрионах с переносом ядра свиней, реконструированных с использованием фетальных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток.

Dev Dyn

2007

;

236

:

435

446

.37

Jin

HF

Kumar

BM

Kim

JG

Song

HJ

Jeong

Jeong Balasubramanian

S

Choe

SY

Rho

GJ

Усиленное развитие эмбрионов свиней, клонированных из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.

Int J Dev Biol

2007

;

51

:

85

90

.38

Buecker

C

Chen

HH

Polo

JM

Daheron

L

L

L

L

Bu Okwieka

P

Porter

A

Gribnau

J

Hochedlinger

K

Geijsen

N

Гоморфная трансгенезия стволовых клеток в человеческих ESC-подобных состояниях.

стволовые клетки

2010

;

6

:

535

546

.39

Hanna

J

Cheng

AW

Saha

K

Kim

J

Ленгнер

Продано Cassady

JP

Muffat

J

Carey

BW

Jaenisch

R

Эмбриональные стволовые клетки человека с биологическими и эпигенетическими характеристиками, аналогичными характеристикам ЭСК мыши.

Proc Natl Acad Sci U S A

2010

;

107

:

9222

9227

.40

Захарченко

V

Mueller

S

Alberio

R

Schernthaner

000

000

Wigerk5000

Wigerk5000 Wanke

R

Lassnig

C

Mueller

M

Wolf

E

Brem

G

Перенос ядра у крупного рогатого скота с нетрансфицированными или клонированными плодами, не трансфицированными и клонированными после фиброза.

Mol Reprod Dev

2001

;

60

:

362

369

.41

Takano

H

Kozai

C

Shimizu

S

Като

Y

множественная ядерная передача.

Териогенология

1997

;

47

:

1365

1373

.42

Захарченко

В

Дурцова-Хиллз

G

Стойкович

M

000 Rix5000

000

000 Шернтанер

Muller

M

Brem

G

Wolf

E

Влияние сывороточного голодания и повторного клонирования на эффективность переноса ядра с использованием фибробластов плода крупного рогатого скота.

J Reprod Fertil

1999

;

115

:

325

331

.43

Вакаяма

T

Синкай

Y

Тамаширо

KL

Niida

KL

Niida

000 Bland

000

000 Bland

000

000

000 Ogura

A

Tanemura

K

Tachibana

M

Perry

AC

Colgan

DF

Mombaerts

P

000 Cl

000 Cl

P

000 Cl

Природа

2000

;

407

:

318

319

.44

Peura

TT

Lane

MW

Lewis

IM

Trounson

AO

, полученный на основе эмбрионов, полученных из эмбриона

ядерная переработка.

Mol Reprod Dev

2001

;

58

:

384

389

.45

Robl

J

Wang

Z

Kasinathan

P

Kuroitechnwa

Y

животноводство.

Териогенология

2007

;

67

:

127

133

.46

Wuensch

A

Habermann

FA

Kurosaka

S

Klose

000 Rex

000

000

000 Rex

000

000

Sinowatz

F

McLaughlin

KJ

Wolf

E

Количественный мониторинг активации гена плюрипотентности после соматического клонирования крупного рогатого скота.

Биол Репрод

2007

;

76

:

983

991

.47

Kubota

C

Tian

C

Yang

X

Серийное клонирование быков путем переноса ядер соматических клеток.

Nat Biotechnol

2004

;

22

:

693

694

.48

Thuan

NV

Кишигами

S

Wakayama

T

Как повысить эффективность технологии клонирования мышей.

J Reprod Dev

2010

;

56

:

20

30

.49

Leandri

RD

Archilla

C

Bui

LC

Peynot

N

9000 9000 Z0004 Liu 9000 Chastellier

A

Renard

JP

Duranthon

V

Выявление динамики экспрессии генов во время активации эмбрионального генома и первой дифференцировки в эмбрионе кролика с помощью специального скрининга массива.

Physiol Genomics

2009

;

36

:

98

113

.50

Roh

S

Прокладка

H

Hwang

WS

Yoon

JT

флуоресцентный белок GG

In vitro эмбрионы крупного рогатого скота после переноса ядра с использованием различных клеточных циклов и пассажей фибробластов плода.

Reprod Fertil Dev

2000

;

12

:

1

6

.51

Uhm

S

Kim

N

Kim

T

Chung

H

Chung

K

Lee

000 Kung

Chung

Chung гены флуоресцентного белка (EGFP) и устойчивости к неомицину (Neo (R)) в эмбрионах свиней после переноса ядра фибробластами плода свиньи, трансфицированными ретровирусным вектором.

Mol Reprod Dev

2000

;

57

:

331

337

.52

Park

K

Lai

L

Cheong

H

Im

G

Sun

Q

Wu

G

Day 4

Потенциал развития эмбрионов свиней с переносом ядра, полученных из трансгенных фибробластов плода, инфицированных геном зеленого флуоресцентного белка: сравнение различных условий слияния / активации.

Биол Репрод

2001

;

65

:

1681

1685

.53

Hyun

S

Lee

G

Kim

D

Kim

H

Lee

Jeong

Y

Kim

S

Yeom

S

Kang

S

Han

J

Lee

B

Hwang

Производство ядерных

с использованием фибробластов свиного плода, трансфицированных усиленным зеленым флуоресцентным белком.Биол

Репродукция

2003

;

69

:

1060

1068

.54

Бординьон

V

Keyston

R

Lazaris

A

Bilodeau

AS

J3 Fecteau

G

Keefer

C

Smith

LC

Экспрессия трансгена зеленого флуоресцентного белка и передача зародышевой линии у клонированных телят, полученных из соматических клеток, трансфицированных in vitro.

Биол Репрод

2003

;

68

:

2013

2023

.55

Канг

JK

Парк

кВт

Чанг

YG

You

YG

You

JS

Kim 9000 SH

Ким 9000 Hong

SP

Choi

KM

Heo

KN

Seol

JG

Lee

JH

Jin

DI

et al.

Скоординированное изменение соотношения метилированного h4-лизина 4 или ацетилированного h4 к ацетилированному h5 и метилирование ДНК связано с тканеспецифической экспрессией гена у клонированной свиньи.

Exp Mol Med

2007

;

39

:

84

96

.

Заметки автора

© 2011 Общество изучения репродукции, Inc.

Генетическая структура домашних кроликов

Резюме

Понимание генетической структуры домашних животных дает возможность заглянуть в процесс одомашнивания и мотивирует разработку исследований, направленных на установление связей между генотипом и фенотипом.Кролики демонстрируют исключительное фенотипическое разнообразие, имеют большую коммерческую ценность и служат важными моделями животных в биомедицинских исследованиях. Здесь мы представляем первый всесторонний обзор нуклеотидного полиморфизма и неравновесия по сцеплению (LD) внутри и среди пород кроликов. Мы повторно секвенировали 16 геномных областей в выборках популяций диких и домашних кроликов и дополнительно 35 фрагментов у 150 кроликов, представляющих шесть обычно используемых пород. Паттерны генетической изменчивости предполагают единственное происхождение одомашнивания диких популяций из Франции, подтверждая исторические записи, согласно которым одомашнивание кроликов происходит во французских монастырях.Уровни нуклеотидного разнообразия как внутри пород, так и между ними составляли ~ 0,2%, но только 60% разнообразия, присутствующего в диких популяциях из Франции, было захвачено домашними кроликами. Несмотря на недавнее происхождение большинства пород, уровни дифференциации популяции были высокими ( F _ST = 17,9%), но большинство полиморфизмов были общими и, таким образом, передавались между породами. Моделирование слияния предполагает, что одомашнивание началось с небольшой основной популяции, составлявшей менее 1200 особей.Принимая во внимание сложную демографическую историю одомашнивания с двумя последовательными узкими местами, два локуса показали отклонения, которые соответствовали искусственному отбору, включая GPC4, который, как известно, связан с темпами роста у людей. Уровни разнообразия между аутосомными и X-сцепленными локусами существенно не различались, что не дает доказательств различий в вкладе самцов и самок в генофонд домашних животных. Структура LD существенно различалась внутри пород и между породами.Внутри пород LD распространяется на большие геномные расстояния. Маркеры, разделенные 400 кб, обычно показывали r ² выше 0,2, а некоторые LD расширялись до 3200 кб. Значительно меньше LD было обнаружено среди пород. Эта выгодная структура LD имеет большие перспективы для сокращения интервала ассоциации в будущих исследованиях картографии.

Ключевые слова: одомашнивание, кролик, нуклеотидное разнообразие, узкое место, искусственный отбор, неравновесие по сцеплению

Введение

Одомашнивание как растений, так и животных — один из самых заметных «экспериментов», когда-либо проводившихся в биологии.Модификация геномов в результате искусственного отбора произвела революцию в человеческих обществах и привлекла внимание биологов по двум основным причинам. Во-первых, тесная связь домашних видов и людей побудила генетические и археологические исследования, направленные на лучшее понимание исторических и культурных условий, а также биологических требований, лежащих в основе превращения дикого вида в его прирученного родственника. Во-вторых, огромное фенотипическое разнообразие, которое обычно обособляется у домашних видов, предоставляет исключительные возможности для установления специфических ассоциаций генотипа / фенотипа и изучения общих механизмов, с помощью которых генетическая изменчивость управляет фенотипическим разнообразием.

Домашний кролик — один из самых недавно одомашненных видов (скорее всего, в течение последних 1500 лет; см. Ниже) и характеризуется исключительно высоким фенотипическим разнообразием: более 200 пород признаны во всем мире (Whitman 2004). Породы сильно различаются по весу, строению тела, типу меха, окраске шерсти и длине ушей, и это видимое морфологическое изменение значительно превышает фенотипическое разнообразие их диких собратьев (). Различия в размерах у домашних кроликов больше, чем у всего семейства Leporidae.Породы кроликов также сильно различаются по размеру помета, скорости роста и поведению. Это огромное фенотипическое разнообразие находит свое отражение в широком спектре коммерческого и лабораторного использования (Weisbroth 1974; Lindsey and Fox 1994; Lebas et al. 1997; Bosze et al. 2003; Fan and Watanabe 2003; Houdebine et al. 2009; Rogel-Gaillard). и др., 2009). Коммерческое использование включает производство мяса, меха, шерсти и лечебных белков, а многие породы выращиваются специально как домашние животные. Более того, кролики имеют множество наследственных болезней, общих для человека (например,д., артериосклероз аорты, катаракта, гипертония, гипертрофическая кардиомиопатия, эпилепсия, расщепление позвоночника, остеопороз и многие другие), что делает их ценными моделями как для биомедицинских, так и для фундаментальных исследований. Кролик также широко используется в исследованиях экстракорпорального оплодотворения, эмбриологии, органогенеза и токсикологии.

Фенотипическая изменчивость домашних и диких кроликов. На нижнем левом рисунке показан типичный фенотип дикого кролика подвида O. c. cuniculus (любезно предоставлено P.К. Алвес). Все остальные изображения иллюстрируют фенотипическое разнообразие, наблюдаемое по многочисленным признакам у домашних кроликов (любезно предоставлено Франсуа Леба, http://www.cuniculture.info и ссылки в нем).

Европейский кролик ( Oryctolagus cuniculus ) является единственным признанным предком домашних кроликов. Этот вид является родным для Пиренейского полуострова, где обнаружены два подвида, разошедшиеся примерно на 1,8 млн лет (Carneiro et al. 2009): O. c. algirus присутствует на юго-западе Пиренейского полуострова, тогда как O.c. cuniculus присутствует на северо-востоке Пиренейского полуострова и во Франции (дополнительный рис. 1, дополнительные материалы в Интернете). Эти подвиды хорошо дифференцированы генетически, хотя есть убедительные доказательства наличия потока генов между ними после вторичного контакта со времен плейстоцена, так что в некоторых локусах аллели от O. c. algirus обнаружены в O. c. cuniculus и наоборот (например, Carneiro et al. 2009). Этот вторичный контакт, вероятно, предшествовал одомашниванию кроликов на тысячи лет.Франция была колонизирована в результате естественного расселения из Северной Испании, вероятно, после последнего максимума ледникового покрова (Queney et al. 2001). Кролики также были завезены людьми во многие места по всему миру (Flux and Fullagar, 1983). Кролики были сначала перевезены по Средиземному морю финикийскими торговцами, позже завезены на Британские острова и другие острова в северо-восточной части Атлантического океана в средние века, а после 18 века — во всем мире (например, в Австралии, Чили, Новой Зеландии, Северной Америке и Южной Америке). Африка).Несмотря на недавнее одомашнивание, противоречивые исторические записи предполагают различное географическое происхождение домашнего кролика. Некоторые исторические записи показывают, что кроликов впервые содержали в неволе на Пиренейском полуострове во время римской оккупации в первом веке до нашей эры, где они содержались в больших вольерах для производства мяса (Clutton-Brock 1999). Поскольку никакого селекционного разведения, по-видимому, не применялось, это не могло считаться истинным одомашниванием. Другие исторические записи, однако, предполагают, что настоящее приручение, включая приручение и селекционное разведение по интересующим признакам, вероятно, началось примерно в 600 году нашей эры во французских монастырях после указа Папы Григория Великого, что новорожденные кролики не считались мясом и поэтому могли быть ели во время Великого поста (Clutton-Brock 1999; Callou 2003; Whitman 2004).В отличие от многих других одомашненных видов (Бруфорд и др., 2003; Добни и Ларсон, 2006), наличие диких популяций позволяет проводить прямое сравнение с одомашненными популяциями, а ограниченные генетические данные с использованием митохондриальной ДНК, Y-хромосомы и данных микросателлитов предположительно предполагают наличие уникальный источник для одомашнивания кроликов во Франции (Hardy et al. 1995; Queney et al. 2002; Geraldes et al. 2005; обзор в Ferrand and Branco 2007). Из этого небольшого набора маркеров также ясно, что домашние кролики обладают меньшим генетическим разнообразием, чем их дикие собратья.После зарегистрированного начала одомашнивания кроликов во французских монастырях, только намного позже возникло большинство пород. К XVI веку во Франции, Италии, Фландрии и Англии было зарегистрировано несколько разновидностей разных размеров и окрасов шерсти, но развитие большинства пород началось не более 200 лет назад (Lebas et al. 1997; Whitman 2004). .

Несмотря на его научную и экономическую ценность, крупномасштабные попытки понять влияние процесса одомашнивания на геном кролика отсутствуют.Чтобы восполнить этот пробел, мы представляем первый исчерпывающий отчет об уровнях и паттернах нуклеотидного полиморфизма у домашних кроликов. Мы исследовали демографическую историю одомашнивания, сравнивая генетические вариации между дикими популяциями и репрезентативным набором из 14 пород по множественным аутосомным и X-сцепленным локусам. Чтобы направлять будущие исследования по картированию, мы также предоставляем первое описание шкалы неравновесия по сцеплению (LD) у кроликов путем повторного секвенирования 35 фрагментов в шести разных породах.Мы акцентируем внимание на пяти основных вопросах. 1) Где были приручены кролики? 2) Какое влияние оказал процесс одомашнивания на уровни и характер генетической изменчивости внутри и между домашними породами кроликов? 3) Каковы были масштабы узкого места при одомашнивании и какая доля генетической изменчивости, присутствующей у диких кроликов, была уловлена ​​процессом одомашнивания кроликов? 4) Предполагают ли паттерны изменчивости аутосомных и X-сцепленных локусов неравный вклад мужчин и женщин в генофонд домашних животных? 5) Какова степень LD среди домашних пород кроликов и внутри них?

Материалы и методы

Стратегия выборки

Наш план выборки был разделен на две основные части.Во-первых, поскольку эта работа была в значительной степени мотивирована сравнением домашних и диких кроликов, была отобрана группа особей, представляющая широкий диапазон генетического разнообразия, обнаруженного как в домашних, так и в диких популяциях. Чтобы максимизировать генетическое разнообразие домашних кроликов и поскольку нет достаточных генетических данных для вывода о родственных связях между породами, мы выбрали породы, которые представляют широкий спектр фенотипов и для которых исторические записи указывают на старое и в основном несвязанное происхождение.Обоснование этого выбора состоит в том, что 1) высокая фенотипическая дивергенция может отражать более высокую генетическую дивергенцию и 2) более старые породы могут представлять собой резервуары генетического разнообразия. Фактически, недавно созданные породы в основном были выведены путем скрещивания между более старыми породами с последующим отбором (Whitman 2004). Были отобраны по одной или две особи для каждой из следующих 14 пород (дополнительная таблица 1, дополнительные материалы на сайте): бельгийский заяц, серебристый шампань, шиншилла (стандарт), английский лоп, английский спот, фов де Бургонь, французская ангора, фламандский великан, Гималайский, венгерский гигант, новозеландский белый, польский, тюрингский и венский белый.Используя небольшое количество особей для набора старых и фенотипически дивергентных пород, мы ожидали: 1) приблизить наследственное генетическое разнообразие домашних кроликов до того, как были внедрены современные методы разведения, и 2) выборочные линии, которые представляют большую часть выявленных генетических вариаций. в первые годы приручения. В дикой природе мы опросили в общей сложности 15 особей из пяти мест во Франции (дополнительная таблица 1, дополнительные материалы в Интернете), а также объединили опубликованные данные последовательностей для репрезентативных выборок различных географических мест, соответствующих диапазону обоих подвидов кроликов в Пиренейский полуостров и образец Lepus granatensis , который использовался в качестве внешней группы в этом исследовании (дополнительный рис.1, Дополнительные материалы в Интернете; Carneiro et al. 2009; Carneiro et al. 2010). Таким образом, мы сравнили четыре группы: Oryctolagus cuniculus algirus ( n = 10, OCA), O. c. cuniculus с Пиренейского полуострова ( n = 12, OCCIP), O. c. cuniculus из Франции ( n = 15, OCCFR) и домашних кроликов ( n = 25, DOM).

Во-вторых, чтобы исследовать закономерности генетической изменчивости и LD внутри и среди пород кроликов, мы отобрали 25 особей для каждой из шести различных пород (дополнительная таблица 1, дополнительный материал онлайн): шампанское серебро, английское пятно, французская ангора, французская лопуха, Новозеландская белая (штамм INRA 1077) и рекс.Чтобы помочь направить будущие исследования на кроликах, мы включили породы, которые отражают различные варианты использования домашних кроликов и являются одними из наиболее часто используемых в агрономических и научных исследованиях. Ангора и рекс в основном используются для производства шерсти и меха. Шампанское серебро, французский лоп и английский спот используются в качестве домашних или выставочных животных; однако первые два являются породами двойного назначения и часто используются для производства мяса. Новозеландская белая порода — наиболее широко используемая порода в лабораторных исследованиях и интенсивном мясном производстве.

Выбор локусов

Для определения уровней и паттернов нуклеотидных вариаций у домашних и французских диких кроликов мы амплифицировали и повторно секвенировали девять аутосомных и семь X-сцепленных интронов (дополнительная таблица 2, дополнительные материалы онлайн). Они были выбраны из набора локусов, использованных в предыдущих исследованиях на диких кроликах с Пиренейского полуострова (Carneiro et al. 2009; Carneiro et al. 2010), что позволяет напрямую сравнивать все четыре группы (OCA, OCCIP, OCCFR и DOM). . Локусы были выбраны без каких-либо априорных знаний о функциональном значении признаков доместикации.Аутосомные локусы были выбраны из разных хромосом или далеко друг от друга на одной и той же хромосоме (хромосомы 4 и 14). На X локусы были выбраны через равные промежутки времени вдоль хромосомы.

Чтобы изучить LD и сравнить образцы генетической изменчивости внутри и между породами, мы сгенерировали последовательности для пяти фрагментов в каждой из семи областей генома, всего 35 фрагментов (дополнительная таблица 2, дополнительные материалы онлайн). Были выбраны области на разных хромосомах вдали от центромерных областей, где рекомбинация, как было показано, сильно снижена для нескольких видов (например,г., Kong et al. 2002). Для каждой из семи областей пять различных сегментов длиной от 250 до 700 пар оснований секвенировали на расстояниях 50, 400, 1200 и 3200 т.п.н. в одном направлении от исходного выбранного фрагмента. Праймеры были разработаны на основе последовательности генома кролика и представлены в дополнительной таблице 3, Дополнительный материал онлайн, вместе с условиями полимеразной цепной реакции. Секвенирование проводилось в обоих направлениях для девяти аутосомных и семи X-сцепленных локусов и из одного направления для исследования LD с использованием автоматического секвенатора ABI 3700.

Анализ данных

Набор данных повторного секвенирования

Следы последовательностей были названы по базе, обрезаны, собраны в контиги и сканированы на гетерозиготы с использованием phred / phrap / consed / polyphred (Nickerson et al. 1997; Ewing and Green 1998; Ewing et al. . 1998; Гордон и др. 1998), вместе со вспомогательными сценариями оболочки и программами Perl, предоставленными Августом Вернером. Все следы и вызовы гетерозигот визуально проверялись и при необходимости редактировались. Данные последовательности были отправлены в GenBank (инвентарные номера: {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs»: {«text»: «HM155112-HM155727», «start_term»: «HM155112», «end_term» : «HM155727», «start_term_id»: «332273158», «end_term_id»: «332273773»}} HM155112-HM155727 и {«type»: «entrez-nucleotide-range», «attrs»: {«text»: «HM454302 -HM459434 «,» start_term «:» HM454302 «,» end_term «:» HM459434 «,» start_term_id «:» 3354 «,» end_term_id «:» 335

6 «}} HM454302-HM459434).

Вывод гаплотипа, уровни вариации, тесты нейтральности и генеалогия

Внутрилокусные гаплотипы были выведены с использованием компьютерной программы PHASE 2.1 (Stephens et al. 2001; Stephens and Donnelly 2003). Этот байесовский подход предполагает нейтральное слияние в пределах одной неструктурированной популяции постоянного размера и учитывает рекомбинацию. Мы применили алгоритм независимо для OCA, OCCIP, OCCFR и DOM. Для Х-сцепленных локусов мы указали, что фаза мужских гаплотипов известна.

Большинство генетических параметров популяции были получены с помощью компьютерной программы SITES (Hey and Wakeley 1997). Мы оценили количество сегрегационных сайтов ( S ), количество гаплотипов ( n haps), минимальное количество событий рекомбинации Хадсона ( R _m , Hudson and Kaplan 1985) и параметр нейтральной мутации, используя метод Уоттерсона. θ _w (Watterson, 1975) и π (Nei, 1987). Мы суммировали уровень генетической дифференциации между популяциями, оценив индекс фиксации ( F _ST , Hudson et al.1992), чистое расхождение нуклеотидов ( D, _a , Nei 1987) и средние попарные различия между популяциями ( D _xy , Nei 1987). Равновесие Харди – Вайнберга (HWE) оценивалось с помощью функции «HWE.exact», реализованной в пакете «генетика» (Warnes and Leisch, 2005) в статистическом программном обеспечении R (R Development Core Team 2009). Функция «Disq» использовалась для оценки коэффициента инбридинга внутри популяции, который определяется как корреляция между аллелями внутри особи (Weir et al.2004 г.).

Частотное распределение полиморфных сайтов сравнивалось с нейтральными ожиданиями с использованием Tajima’s D (Tajima 1989). Чтобы сгенерировать нулевое распределение этой статистики, мы использовали коалесцентное моделирование с использованием DnaSP 4.50.3 (Розас и др., 2003). Мы выполнили 10 ⁴ коалесцентных имитаций стандартной нейтральной модели в зависимости от размера выборки и наблюдаемых оценок θ _w . Чтобы обнаружить отклонения в количестве наблюдаемых гаплотипов по сравнению со стандартной нейтральной моделью, мы использовали статистику Стробека S (Strobeck 1987).Нейтральный прогноз постоянного отношения полиморфизма к дивергенции оценивался с помощью теста Хадсона – Крейтмана – Агуаде (HKA) (Hudson et al. 1987). Мы провели мультилокусные тесты с использованием программы HKA Джоди Хей.

Эволюционные отношения между аллелями оценивались с использованием сетей соединения медианы (Bandelt et al. 1999), реализованной в программном обеспечении NETWORK 4.2.0.1.

Демографический вывод с использованием коалесцентного моделирования

Мы использовали компьютерное моделирование процесса слияния для исследования демографической истории домашних кроликов.Моделирование проводилось с использованием алгоритма, описанного Hudson (1990) и реализованного в программе ms (Hudson 2002). Статистические данные были рассчитаны с использованием msstats (Thornton 2003).

Диаграммы и параметры демографических моделей, используемых в симуляциях, изображены и аналогичны тем, которые применяются к другим одомашненным видам (Eyre-Walker et al. 1998; Tenaillon et al. 2004; Wright et al. 2005; Haudry et al. 2007; Чжу и др. 2007). Согласно историческим записям и генетическим свидетельствам (см. «Введение», «Результаты и обсуждение»), домашние кролики, по-видимому, произошли от OCCFR; поэтому мы предположили, что это население является источником DOM.Целью нашего моделирования было сделать вывод о серьезности узкого места приручения ( k _dom = N _bdom / d _dom ), где N _bdom — это размер узкого места. население и d _dom длительность узкого места в поколениях. Из-за недавней колонизации Франции — вероятно, после последнего ледникового максимума — и, как следствие, узкого места (см. Введение и Результаты и Обсуждение), мы включили это демографическое событие в наши модели ( k _fr ).Модель, имитирующая колонизацию Франции, состояла из двух популяций и аппроксимирует «узкое место» из одной исходной популяции, в которой предковая популяция постоянного размера ( N _a ) дает начало в момент времени t 2 _fr до a небольшая популяция учредителей ( N _bfr ). Совсем недавно население узких мест во время t 1 _fr ( d _fr = t 2 _fr — t 1 _fr ) мгновенно расширилось до своего текущего размера ( N _{). pfr} ).Модель, используемая для оценки серьезности эффекта узкого места в событии одомашнивания DOM, аналогична и описывается аналогичными параметрами ( N _bdom , N _pdom , d _dom и k _dom ), но включал третью популяцию (DOM) и включал оценочный параметр k _fr для формирования популяции OCCFR из первой модели. Эту модель можно кратко охарактеризовать как два последовательных узких места, за которыми следует рост во время колонизации Франции дикими кроликами и при одомашнивании.В обеих моделях популяции остаются изолированными после первоначального разделения.

Схематическое изображение сливающихся моделей, используемых для представления основных событий демографической истории французских диких кроликов (слева) и домашних кроликов (справа). См. «Материалы и методы» для подробного описания всех параметров и допущений.

Мы использовали ряд предположений. Сначала для каждого локуса была определена частота нейтральных мутаций из соотношения μ = D /2 T , где D — расчетное значение D _xy для сравнения Oryctolagus / Lepus (доступны значения в Carneiro et al.2010), а T — время расхождения для разделения двух родов, которое, как полагают, произошло 11,8 млн лет назад (Matthee et al. 2004). Для UD14 у нас не было последовательности вне группы, и μ рассчитывали как среднее значение среди других аутосомных локусов. Во-вторых, учитывая предполагаемую частоту нейтральных мутаций, N _a перед разделением между OCCIP и OCCFR оценивали для каждого локуса из параметра популяционной мутации (θ), оцененного для OCCIP. Обратите внимание, что θ = 3 N _e μ для X-сцепленных локусов и θ = 4 N _e μ для аутосомных локусов.В-третьих, мы предположили, что промежуток времени между OCCIP / OCCFR и OCCFR / DOM составляет 10 000 (после последнего ледникового максимума) и 1400 лет (начальное событие приручения), соответственно (см. Введение). Мы предположили, что время генерации составляет 1 год (Soriguer, 1983). Хотя время разделения следует считать приблизительным, мы провели дополнительное моделирование для подмножества локусов, изменяя время разделения в 3 раза в обоих направлениях, и обнаружили, что оценки k _fr и k _dom для каждого локуса остались. аналогичные (данные не показаны).Этот результат также указывает на то, что небольшие неточности в оценках скорости мутаций и времени генерации вряд ли изменят наши выводы, что неудивительно, потому что это короткий временной масштаб для того, чтобы мутация оказала существенное влияние. В-четвертых, аналогично N _a , значения N _pfr и N _pdom были получены из параметра популяционной мутации. Далее мы изменили N _pfr и N _pdom на один порядок в обоих направлениях, и результаты остались в основном неизменными (данные не показаны).В-пятых, мы включили внутригенную рекомбинацию во все моделирование. Параметр рекомбинации популяции (ρ = 4 N _e r ) оценивали для каждого локуса из данных OCCIP с использованием γ (Hey and Wakeley 1997). γ — оценка максимального правдоподобия (ML), разработанная с использованием модели слияния для образца из четырех последовательностей ДНК с рекомбинацией. Наконец, ранее для аналогичных протоколов было показано, что параметр k является составным параметром, а N _b и d положительно коррелированы (Eyre-Walker et al.1998; Tenaillon et al. 2004 г.). Эта тенденция наблюдалась и в наших расчетах. По этой причине мы представляем результаты d _fr и d _dom , зафиксированных на 500 поколениях, для которых мы использовали несколько значений N _bfr и N _bdom , так что параметры k _fr и k _dom находились в диапазоне от 0,1 до 16 с интервалом 0,1.

Чтобы обусловить моделирование наблюдаемыми данными, мы использовали выборку отклонения, основанную на трех сводных статистических данных: среднее попарное расхождение нуклеотидов на последовательность (π), количество сегрегационных сайтов ( S ) и количество гаплотипов ( n haps).Обусловляя смоделированные значения наблюдаемыми данными, мы избегаем искажения наших оценок особенностями демографической истории, которые не учитываются в нашей модели. Для демографического сценария, воспроизводящего колонизацию Франции, мы подогнали смоделированные данные к наблюдаемым данным последовательности OCCIP, тогда как для модели одомашнивания мы смоделировали OCCIP как предковую популяцию и принудили моделирование к наблюдаемым данным OCCFR. Моделирование регистрировалось, если полученные значения находились в пределах 20% от наблюдаемых значений, и продолжалось до получения 10 000 генеалогий.

Чтобы найти наиболее подходящее значение параметра для k _fr и k _dom , значение правдоподобия для каждого локуса было оценено как доля 10000 симуляций, суммарная статистика которых ( S , π и n haps) находятся в пределах 20% от наблюдаемых значений. Значение ML для глобального набора данных было оценено только для k _dom как произведение вероятности для каждого локуса. Мы рассчитали 95% доверительные интервалы (ДИ) вокруг оценки ML k _dom , определив значение, для которого значения логарифма правдоподобия были на две единицы логарифмического правдоподобия ниже, чем наилучшая оценка.Наконец, мы использовали мультилокусное значение ML k _dom для выполнения дополнительных симуляций слияния в каждом локусе, чтобы исследовать, отклоняются ли некоторые локусы значительно от предполагаемой нейтральной демографической модели. Мы сгенерировали эмпирическое распределение с 10000 повторениями и спросили, были ли уровни разнообразия для конкретного локуса, измеренные как S , π и n haps, ниже ожидаемого ( P <0,05) с учетом предполагаемого мультилокусная оценка k _dom .

LD Анализ

Полиморфные однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) или маркеры вставки и делеции (indel), имеющие более 10% отсутствующих данных и / или второстепенные аллельные частоты в пределах породы ниже 10%, были исключены из анализа. LD была измерена с использованием генотипа r ² (Weir et al. 2004), который не основывается на каких-либо предположениях о частотах аллелей в выборке. Эта статистика была рассчитана для всех парных сравнений между маркерами с использованием функции «LD», реализованной в пакете R «genetics» (Warnes and Leisch 2005).

Исторические оценки эффективного размера популяции были получены из ожидания распада LD с генетическим расстоянием с использованием модели E ( r ² ) = (1/4 N _t c +1) + (1 / n ) (Sved 1971), где E ( r ² ) является средним из значений r ² между маркерами в семи геномных регионах для заданного расстояния, N _t — эффективный размер популяции при t поколениях в прошлом, c — генетическое расстояние между маркерами у Morgans, а n — количество выбранных хромосом.Мы предположили, что t = 1 / (2 c ) (Hayes et al.2003) и среднюю скорость рекомбинации 1 см = 1 МБ на основе общей длины генетической карты кроликов (2766,6 см, исключая хромосомы 20, 21, и X) и размером генома примерно 3 ГБ (Chantry-Darmon et al. 2006).

Результаты и обсуждение

Единое географическое происхождение одомашнивания

Несколько предыдущих исследований растений и животных документально подтвердили наличие нескольких центров одомашнивания одного и того же вида (Diamond 2002; Bruford et al.2003). Чтобы обратиться к истокам одомашнивания кроликов, мы повторно секвенировали девять аутосомных и семь X-сцепленных интронов, длина которых варьировалась от 705 до 1314 пар оснований (дополнительная таблица 2, дополнительные материалы онлайн). В общей сложности мы получили ∼16,1 т.п.н. последовательности на индивидуума (∼10,8 т.п.н. для аутосомных локусов и ∼5,3 т.п.н. для X-сцепленных локусов). Уровни дифференциации и генеалогии были сопоставлены между дикими кроликами аборигенного ареала и репрезентативным набором из 14 пород домашних кроликов (дополнительная таблица 1, дополнительные материалы онлайн).На протяжении всего исследования мы рассматривали четыре популяции: OCA, OCCIP, OCCFR и DOM.

Различные аспекты данных подтвердили более тесную связь между OCCFR и DOM, чем между DOM и дикими кроликами с Пиренейского полуострова (OCA и OCCIP). Во-первых, генетическая дифференциация между DOM и OCCFR ( F _ST = 15,0%, D _a = 0,060%, D _xy = 0,341%; дополнительная таблица 4, дополнительные материалы онлайн) была значимой. ниже, чем между DOM и OCA ( F _ST = 52.1%, D _a = 0,556%, D _xy = 0,979%) или DOM и OCCIP ( F _ST = 25,6%, D _a = 0,142%, D _xy = 0,547%) ( P <0,025 во всех случаях по критерию рангового знака Вилкоксона). Это согласуется с данными для микроспутников (Queney et al. 2002). Во-вторых, простой визуальный осмотр генеалогии генов также предполагает, что гаплотипы в DOM являются подмножеством гаплотипов в OCCFR.Например, 78,2% гаплотипов, обнаруженных в DOM, были общими с OCCFR, тогда как только 49,1% и 18,2% были общими с OCCIP и OCA, соответственно. Фактически, из 45 гаплотипов, обнаруженных в DOM, которые были общими с дикими популяциями, единственный гаплотип в UD14 был общим не с OCCFR, а с OCCIP. Более того, несколько гаплотипов, которые присутствовали в DOM, были обнаружены исключительно в OCCFR, и это наблюдалось для нескольких генов (ATP12A, CYTC, MGST3, STAG1, UD14, DIAPh3 и PGK1). Эти результаты остались неизменными, когда мы ограничили анализ гаплотипов порогами доверительной вероятности PHASE выше 0.8.

Коробчатые диаграммы, изображающие генетическую дифференциацию между домашними кроликами и каждой из популяций диких кроликов, рассматриваемых в данном исследовании. Уровни генетической дифференциации между домашними кроликами и дикими кроликами оценивали с использованием индекса фиксации ( F _ST , A ), чистой нуклеотидной дивергенции ( D _a , B ) и среднего попарного различия между популяциями ( D _xy , C ).Уровни генетической дифференциации предполагают более тесную близость между домашними кроликами (DOM) и французскими дикими кроликами (OCCFR).

Медианные сети гаплотипов, представляющие эволюционные отношения между аллелями, обнаруженными как у домашних, так и у диких кроликов. Лица с недостающими данными были исключены. Размер кружков пропорционален частоте каждого гаплотипа. Группы населения обозначены черным для OCA, белым для OCCIP, синим для OCCFR и красным для DOM. Обратите внимание на существенное совместное использование гаплотипов между DOM и OCCFR и отсутствие гаплотипов OCA в DOM для всех генов, демонстрирующих фиксированную вариацию между подвидами.

Наши результаты также показывают, что подвид O. c. cuniculus , по-видимому, является единственным прямым источником всех домашних кроликов (т. е. нет никаких доказательств того, что домашние кролики произошли непосредственно от ОСК). В соответствии с предыдущими исследованиями вариабельности последовательности митохондрий и Y-хромосомы (Hardy et al. 1995; Geraldes et al. 2005), у подвидов не было общих аллелей в одном аутосомном (STAG1) и двух X-сцепленных локусах (F9 и POLA1). в нашем наборе данных, и в каждом случае все гаплотипы DOM принадлежат к линии, обычно обнаруживаемой в OCCIP и OCCFR ().Мы отмечаем, что другие таксоны также вряд ли способствуют одомашниванию кроликов, поскольку европейский кролик является единственным видом в роду Oryctolagus и почти наверняка репродуктивно изолирован от других лепорид. Считается, что наиболее близкородственные роды ( Caprolagus , Bunolagus и Pentalagus ) отошли от Oryctolagus по крайней мере на 8,5 млн лет (Matthee et al. 2004).

Тем не менее, OCA, вероятно, косвенно вносил вклад в генофонд домашних кроликов посредством интрогрессивной гибридизации в гибридной зоне кроликов.Например, некоторые генеалогии генов, проиллюстрированные в (DIAPh3, KLHL4, LUM и MAOA), состояли из двух различных гаплогрупп, разделенных длинной внутренней ветвью. Эти генеалогии имели схожую форму по сравнению с генеалогиями, не показывающими общих различий между подвидами, но тот факт, что обе линии не показали соответствия с географией (то есть общие для обоих подвидов), наводит на мысль о обширном смешении после вторичного контакта для некоторых областей генома. Фактически, высокий уровень потока генов между OCA и OCCIP для каждого из этих локусов был сделан с использованием модели изоляции с миграцией (Carneiro et al.2009; Carneiro et al. 2010). Интересно, что DOM и OCCFR имеют обе дивергентные линии в KLHL4 и MAOA, что дает убедительные доказательства того, что в некоторые локусы гаплотипы OCA интрогрессировали до Франции посредством естественной гибридизации и впоследствии были включены в одомашненный генофонд. Другими словами, обширный поток генов между подвидами — вероятно, после последнего ледникового максимума, но до одомашнивания — привел к высоким уровням интрогрессии некоторых частей генома. Таким образом, эти интрогрессированные области уже присутствовали в популяциях диких кроликов до появления одомашнивания.

Несколько наблюдений показывают, что одомашнивание кроликов необычно по сравнению с большинством одомашненных млекопитающих. Во-первых, единственное французское происхождение домашних кроликов кажется вероятным и подтверждается комбинацией исторических записей (Clutton-Brock 1999; Callou 2003; Whitman 2004) и генетических данных из этого и предыдущих исследований (обзор в Ferrand and Branco 2007). Этот простой сценарий одомашнивания резко контрастирует с большинством видов животных (например, крупного рогатого скота, ослов, коз, лошадей, свиней и овец), которые характеризуются независимыми событиями одомашнивания либо из нескольких географических регионов, либо даже из нескольких подвидов или видов (Bradley et al. al.1996; Vila et al. 1997; Luikart et al. 2001; Hiendleder et al. 2002; Jansen et al. 2002; Бежа-Перейра и др. 2004; Larson et al. 2005). Во-вторых, в отличие от многих других одомашненных видов, чьи дикие предки считаются вымершими (например, лошади и крупный рогатый скот) или для которых идентичность всех диких видов, генетически внесших вклад в домашнюю популяцию, не ясна (например, овцы, козы, and cat; Dobney and Larson 2006), у кроликов есть известные и существующие виды-предки. Третье важное отличие касается географической области одомашнивания.Кролик — единственный вид млекопитающих, который был одомашнен исключительно в Западной Европе, в отличие от большинства случаев одомашнивания животных, которые произошли в трех основных регионах: Юго-Западная Азия, Восточная Азия и Америка (Clutton-Brock 1999; Diamond 2002; Bruford et al. 2003 г.). Наконец, одомашнивание кроликов началось в течение последних 1500 лет (Clutton-Brock 1999; Callou 2003; Whitman 2004). Это сравнительно недавно по сравнению с большинством других млекопитающих, которые, как считается, были одомашнены более 5000 лет назад, а приручение собак могло начаться уже 14000 лет назад (Clutton-Brock 1999; Diamond 2002; Bruford et al.2003). Гораздо более поздняя дата одомашнивания кроликов могла быть связана с более целенаправленными и целенаправленными усилиями по одомашниванию (Zeder 2006) и может частично объяснить, почему процесс одомашнивания кроликов в нескольких аспектах отличается от других одомашненных млекопитающих (см. Ниже).

Уровни генетической изменчивости, сильной структуры породы и отклонения от равновесия дрейфа мутаций

Уровни нуклеотидного разнообразия (π) в DOM в среднем составляли 0,188% и 0,205% для аутосомных и X-сцепленных локусов, соответственно (), но были существенные гетерогенность среди локусов с π от 0% до 0.760% (дополнительная таблица 5, дополнительные материалы онлайн). Хотя средние значения π для РОВ были аналогичны таковым у других одомашненных видов, таких как крупный рогатый скот (π = 0,140–0,247%, Gibbs et al. 2009) и собаки (π = 0,1%, Brouillette et al. 2000), они были значительно ниже, чем соответствующие значения для каждой из популяций диких кроликов, рассматриваемых в этом исследовании, как для Х-хромосомы, так и для аутосом ( P <0,025 во всех случаях по критерию рангов со знаком Вилкоксона; дополнительная таблица 6, дополнительный материал онлайн) .То же самое верно для θ _w и количества гаплотипов, как видно из сетей гаплотипов, изображенных на. Среднее количество событий рекомбинации ( R _m ) также было существенно ниже в DOM, чем в OCA, OCCIP и OCCFR (). В соответствии с недавней колонизацией Франции генетическая изменчивость OCCFR была в значительной степени подвыборкой из OCCIP. В целом параметры разнообразия домашних кроликов соответствуют узкому месту приручения, наблюдаемому у многих домашних животных (Wright et al.2005; Hamblin et al. 2006; Лю и Берк 2006; Haudry et al. 2007; Zhu et al. 2007; Muir et al. 2008; Gray et al. 2009 г.). Важно отметить, что уровни генетического разнообразия указывают на то, что текущие проекты по открытию SNP для кроликов приведут к созданию большой коллекции полиморфных SNP, которые, вероятно, будут связаны с большинством генов в геноме.

Таблица 1.

Резюме анализов полиморфизма, частотных спектральных тестов на нейтральность и рекомбинацию в OCA, OCCIP, OCCFR и DOM для девяти аутосомных и семи X-сцепленных локусов.

9425 Общий 9025 9025

Локус	Население	Среднее значение π (%) a	Среднее значение θ w (%) b	Среднее значение D T	Среднее значение R м d
Аутосомно	OCA	0,721	0,850	-0,645	9025 IP658	0,727	-0,369	4,0
	OCCFR	0,348	0,375	-0,368	2,1
0,125 9025 0,12		9025 9025
Х-сцепление	OCA	0,554	0,557	-0,065	1,0
	OCCIP	0,581	0.596	-0,236	1,1
	OCCFR	0,394	0,283	1,012	0,4
			0157						0259	OCA	0,648	0,722	−0,391	2,2
	OCCIP	0,625	0,670	−0.311	2,8
	OCCFR	0,368	0,335	0,236	1,4
	DOM	0,195
0,128	0,125 изучили, как генетическая изменчивость была организована внутри и между породами. Мы повторно секвенировали пять фрагментов из каждой из семи областей генома, всего 35 фрагментов по несколько сотен пар оснований каждый (см. Методы).Этот дизайн был реализован для выяснения структуры LD, как описано ниже. Секвенировали 25 особей каждой из шести пород. В соответствии с глобальными уровнями разнообразия пород, средние уровни генетического разнообразия внутри пород были высокими, при этом значения π варьировались от 0,215% для английской пятнистости до 0,313% для французской ангоры (обобщены в дополнительной таблице 7 и подробно описаны в дополнительной таблице 8, дополнительная информация Материал онлайн). Парные значения F ST среди пород (усредненные по локусам) варьировали от 7.5% и 32,9% (), что указывает на то, что большая часть общей генетической изменчивости была внутри породы, а не между породами. Однако, несмотря на недавнее происхождение большинства пород, средние уровни дифференциации популяции при попарных сравнениях ( F ST = 17,9%) были высокими, что свидетельствует о том, что породы в целом поддерживались как закрытые генофонды. Дополнительную значимость для исследований картирования имеет то, что полиморфизмы, характерные только для одной породы, были редкими (7,9% от общего числа маркеров, исключая одиночки), и, таким образом, большинство генетических маркеров должны быть информативными и передаваться между породами.Как и ожидалось, учитывая эту структуру популяции, когда все шесть пород рассматривались вместе, 89,6% маркеров показали значительные отклонения от HWE ( P <0,05; дополнительная таблица 7, дополнительные материалы онлайн). Напротив, когда мы рассматривали каждую породу отдельно, гораздо меньший процент локусов показал отклонения от ожиданий Харди – Вайнберга (HW). Коэффициент инбридинга, рассчитанный по отклонениям HW и усредненный по маркерам, сильно варьировал среди пород: 0,25 для шампанского серебра, 0.18 для English Spot, -0,05 для French Angora, 0,16 для French Lop, 0,09 для New Zealand White и 0,14 для Rex (дополнительная таблица 7, дополнительные материалы онлайн). Таблица 2. Средние парные F ST значения (%) среди шести пород домашних кроликов. ES4 9025 9025 Порода CS ES FA FL NZ CS — — FA 10,8 22,0 — FL NZ 25,6 32,9 24,2 22,4 — RX 12,5 13,4 17,4 7,5 26.1 Наконец, мы проверили отклонения от модели нейтрального равновесия, чтобы оценить влияние процесса одомашнивания на паттерны генетической изменчивости. Нашей целью было не обнаружение отбора в определенных локусах, а предварительная оценка изменений на уровне популяции, которые могли сопровождать процесс одомашнивания, и проведение демографического моделирования, представленного ниже. Мы наблюдали большой сдвиг в частотном распределении полиморфизмов между дикими и домашними кроликами ().В диких популяциях с полуострова Иберия наблюдаемые средние значения D Таджимы ( D = -0,391 для OCA и D = -0,311 для OCCIP) были отрицательными, что указывает на перекос в сторону низкочастотных вариантов, хотя и незначительно. отличается от нуля по сравнению с распределением, моделируемым множеством локусов ( P > 0,1 в обоих случаях). Напротив, как OCCFR, так и DOM характеризовались противоположным паттерном. В OCCFR показатель D Tajima был слегка положительным, но также незначительно отличался от нуля ( D = 0.236, P > 0,1). Поразительно, что среднее значение D Tajima для DOM было положительным и значительно отличалось от нуля ( D = 0,612, P <0,05), что указывает на нехватку низкочастотных полиморфизмов. Этот образец согласуется с сокращением популяции, потому что низкочастотные варианты быстро теряются, когда популяция подвергается значительному уменьшению в размере. Значения Tajima D для каждого локуса варьировались от -2,073 до 2,467 (дополнительная таблица 5, дополнительный материал онлайн), при этом некоторые локусы демонстрируют значительные перекосы в частотном спектре аллелей как для положительных (ATP12A и MGST3), так и для отрицательных значений (UD14, KLHL4). , MAOA и PGK1).Стробек S указывает, что меньше гаплотипов наблюдалось, чем ожидалось в рамках модели равновесия для четырех локусов в DOM (LUM, PRL, KLHL4 и MAOA), но только для двух локусов в OCCFR (KLHL4 и MAOA), и ни одного в обоих OCA. и OCCIP (дополнительная таблица 5, дополнительные материалы в Интернете). Аналогичным образом, мультилокусные тесты HKA показали отклонения от модели нейтрального равновесия в DOM ( P = 0,000) и OCCFR ( P = 0,002), но не в OCA ( P = 0,761) или OCCIP ( P = 0.611; дополнительный рис. 2, Дополнительные материалы в Интернете). В DOM последовательное устранение пяти локусов (MAOA, ATP12A, PRL, MGST3 и KLHL4) было необходимо для получения набора данных, который существенно не отличался от нейтральных ожиданий ( P = 0,05). Подобные отклонения от нейтральности были выведены из полиморфизма внутри пород (дополнительная таблица 8, дополнительный материал онлайн), демонстрируя, что структура породы сама по себе не может объяснить эти закономерности. Хотя нельзя исключить влияние отбора (см. Ниже), маловероятно, что все эти регионы находились под отбором во время одомашнивания кроликов.Вместо этого многие из наблюдаемых отклонений от модели нейтрального равновесия, вероятно, являются результатом эффектов последовательных узких мест (колонизация Франции, начальная стадия одомашнивания и последующее создание пород) в сочетании с древней популяционной структурой в диких популяциях от какие домашние кролики были выведены. Эти результаты подчеркивают проблему обнаружения признаков искусственного отбора у кроликов с помощью классических тестов нейтральности, основанных на равновесных моделях.Чтобы обойти эту проблему, мы смоделировали процесс приручения, как описано ниже. Серьезное препятствие на ранних стадиях приручения, небольшие эффективные размеры популяции внутри пород и выявление искусственного отбора с использованием неравновесной модели Мы количественно определили количество утраченного генетического разнообразия в начале одомашнивания кроликов по сравнению с исходной популяцией диких кроликов во Франции с использованием следующих величин: 1 − π DOM / π OCCFR и 1 − θ wDOM / θ wOCCFR .Степень утраты разнообразия сильно различалась между локусами (дополнительный рисунок 3, дополнительный материал онлайн). Удалив GPC4 и LUM, которые значительно отклоняются от ожидаемых значений, учитывая масштабы узкого места при одомашнивании (см. Ниже), домашние кролики потеряли 37,1% генетического разнообразия на основе π и 43,8% на основе θ w в среднем. Небольшая разница между двумя значениями, вероятно, объясняется разной чувствительностью двух оценщиков к низкочастотным вариантам. Одомашнивание кроликов, по-видимому, привело к большей потере генетического разнообразия, чем это наблюдается у других домашних млекопитающих. Например, Gray et al. (2009) сообщили о умеренном сокращении генетического разнообразия у собак (5%), указывая на то, что они, вероятно, претерпели меньшее сокращение популяции в результате одомашнивания. Аналогичным образом большинство исследований на свиньях также показали, что одомашнивание не привело к заметному снижению изменчивости (Ojeda et al. 2006, 2008). Хотя оценка количества вариаций, улавливаемых у большинства домашних животных, затруднена тем фактом, что дикие предки вымерли или труднодоступны, два доступных примера, описанных выше, предполагают, что одомашнивание кроликов привело к значительной потере генетического разнообразия по сравнению с другими млекопитающими. .Единый источник одомашнивания кроликов может внести свой вклад в некоторые наблюдаемые различия в количестве разнообразия, полученного от диких популяций. В этом отношении процесс одомашнивания кроликов больше похож на несколько примеров у растений, для которых сообщалось о сопоставимых потерях изменчивости, связанных с одомашниванием (например, Wright et al. 2005; Burke et al. 2007). Учитывая, что несколько характеристик данных поддерживают узкое место приручения, мы провели моделирование, чтобы оценить его серьезность, k dom = N bdom / d dom , где N bdom — размер популяции с узким местом, а d dom — это продолжительность в поколениях начального узкого места.Меньшие значения k dom указывают на более серьезные сокращения генетического разнообразия. В нашей модели () предковая популяция претерпевает два последовательных узких места, соответствующих тем, которые возникли при последниковой колонизации Франции ( k fr ) и инициации одомашнивания ( k dom ). После каждого узкого места модель учитывает мгновенное увеличение численности популяции. Мы провели совместное моделирование, варьируя k от и k dom , и использовали анализ согласия, сравнивая сводные статистические данные, вычисленные на основе наблюдаемых данных, со статистическими данными, вычисленными на смоделированных данных. Количество сегрегационных сайтов ( S ) и гаплотипов ( n haps) давало неплоские унимодальные распределения правдоподобия для большинства локусов, тогда как для π мы получили несколько пологие кривые при больших значениях k dom и k. fr (дополнительные рисунки 4 и 5, дополнительные материалы онлайн). Поскольку единая сводная статистика может не отражать важные аспекты данных, мы оценили мультилокус k dom , используя комбинацию всех трех статистических данных.Чтобы избежать смещения наших оценок по локусам, которые значительно отклонялись в уровнях разнообразия от ожидаемых значений, учитывая величину узкого места, предположительно из-за отбора, мы провели дополнительное моделирование и спросили, совместима ли наблюдаемая потеря разнообразия для каждого локуса с мультилокусом. эстимейт к дом . Локусы, которые показали значительные отклонения при P <0,05, были последовательно удалены, и k dom повторно оценивали итеративно до тех пор, пока не было получено значимого результата.Эта процедура привела к удалению двух локусов (GPC4 и LUM), предполагая, что эти локусы могут быть предметом отбора, как более подробно обсуждается ниже. Оценка ML k dom для оставшихся 15 локусов составила 2,8 (два предела поддержки логарифмического правдоподобия = 1,6–6,6;) и, как показано ранее (Eyre-Walker et al. 1998; Tenaillon et al. 2004) , d dom и N bdom были положительно коррелированы с различными комбинациями значений, дающими идентичные оценки (данные не показаны).Используя исторические записи, мы можем установить верхний предел продолжительности узкого места приручения. К 16 веку было признано несколько разновидностей, что свидетельствует о том, что приручение кроликов уже было завершено в это время. Учитывая взаимосвязь k dom = N bdom / d dom , и допуская, что максимальное количество поколений составляет 900 (одно поколение в год) на время узкого места приручения кролика ( d dom ), по нашим оценкам, около 1200 особей (2400 хромосом) могут объяснить количество генетического разнообразия, зафиксированного на начальных этапах приручения кроликов.И наоборот, разнообразие последовательностей у домашних кроликов можно объяснить узким местом с более короткой продолжительностью и меньшим количеством особей. Например, если предположить, что 10 поколений ограничены, всего 14 особей в принципе могут объяснить генетическое разнообразие, зафиксированное при одомашнивании кроликов. Эти результаты моделирования показывают, что одомашнивание кроликов сопровождалось довольно серьезным узким местом в 1200 особей или меньше, что намного меньше, чем эффективный размер популяции диких кроликов во Франции (OCCFR, N e = 538 239) или в Северной Испании (OCCIP, N e = 1 043 467), полученный с использованием простого ожидания дрейфа мутаций (θ = 4 N e μ, где θ — среднее значение θ w для всех аутосомных локусов, μ — средняя частота мутаций, μ = 1.74 × 10 -9 было получено из сравнения между кроликами и Lepus (). Диаграмма, представляющая мультилокусную оценку ML для силы узкого места населения ( k ). Мультилокус ML (ось y , логарифмическая шкала) параметра k (ось x ) оценивался как произведение вероятности для каждого локуса. Наиболее подходящее значение параметра k для каждого локуса оценивалось как доля 10000 симуляций, суммарная статистика которых ( S , n haps , и π) находилась в пределах 20% от наблюдаемых значений.GPC4 и LUM не были включены. Мы использовали степень и величину LD в семи регионах генома в качестве дополнительного инструмента для демографических выводов. Используя модель, которая описывает ожидаемое количество LD как функцию генетического расстояния и эффективного размера популяции (Sved 1971; Hayes et al. 2003), мы исследовали тенденцию изменения эффективного размера популяции во времени от до 2 Значения на разных геномных расстояниях для шести разных пород. Интервалы расстояний, используемые в нашем дизайне выборки, которые варьировались от 50 кб до 3200 кбайт, соответствовали временному интервалу от ~ 15 до 1000 поколений в прошлом (см. Методы).Мы сделали вывод о снижении эффективной численности популяции для всех пород за рассматриваемый период времени (). Это снижение, по-видимому, было сильнее в последних поколениях, и самые последние оценки эффективного размера популяции варьировались от 28 особей у новозеландской белой породы до 93 особей у французской лопной породы. Наблюдение за сильной породной структурой, достигнутой у кроликов за короткий период времени, согласуется с этой идеей. Исследования изменения эффективного размера популяции во времени с использованием информации о LD у других домашних видов, таких как крупный рогатый скот и куры, также показали недавнее снижение эффективных размеров внутри пород, предполагая, что это обычная тенденция среди домашних животных (Gibbs et al.2009; Megens et al. 2009 г.). Оценки эффективной численности популяции ( N e ) с течением времени от настоящего (поколений). Взаимосвязь между эффективным размером популяции (ось y ) и временем генерации из настоящего (ось x ) была оценена на основе данных LD с использованием модели Sved (1971). Серебряное шампанское (CS), английское пятно (ES), французская ангора (FA), французская лопуха (FL), новозеландская белая (NZ) и Rex (RX). Мы использовали мультилокусную оценку k dom , чтобы спросить, произошла ли большая, чем ожидалось, потеря разнообразия в DOM по сравнению с OCCFR для конкретных локусов, паттерн, соответствующий положительному отбору.Этот метод определения геномных областей при отборе не полагается на условия равновесия и ищет выбросы по сравнению с нулевой моделью, которая специально включает два узких места, изображенных на. Уровни вариации в большинстве локусов существенно не отличались от нейтральных ожиданий в рамках этой неравновесной демографической модели (). Однако GPC4 и LUM показали большее сокращение разнообразия для всей сводной статистики, помимо того, что можно было бы приписать только мультилокусной оценке k dom , что позволяет предположить, что эти регионы могли быть предметом отбора в процессе одомашнивания.GPC4 представляет особый интерес, потому что это второй наиболее изменчивый локус в OCCFR, но инвариантный в DOM. Более того, GPC4 имел наивысшее значение F ST между DOM и OCCFR (дополнительная таблица 4, дополнительные материалы онлайн). Мутации в GPC3 и GPC4, которые расположены рядом друг с другом, участвуют в пре- и постнатальном избыточном росте у людей (Pilia et al. 1996), а регуляторные вариации в GPC3 во многом ответственны за реакцию на отбор на рост у мышей (Oliver et al.2005). Интересно, что увеличенный размер, вероятно, был одним из первых признаков, которые были выбраны у домашних кроликов (Clutton-Brock 1999), что повышает интригующую возможность того, что GPC4 сам был целью отбора. Альтернативно, также возможно, что GPC4 не был прямой мишенью отбора и что он отражает паттерны отбора на связанных генах. Таблица 3. Доля моделирования с более низкими значениями, чем наблюдаемые данные, предполагающие мультилокусную оценку величины узкого места ( k dom = 2.8). 0,709 0,709 0,707 Локус S a n гаапс b π c ATP129 0,69 0,69 CYTC 0,746 0,842 0,588 EXT1 0,436 0,555 0,532 LUM 0.022 0,001 0,005 MGST3 0,611 0,153 0,010 PRL 0,755 0,611 9025 9425 0,611 9025 9425 ТИАМ1 0,113 0,772 0,130 УД14 0,211 0,986 0,606 ДИАПх3 9025.875 0,295 0,751 F9 0,865 0,868 0,441 GPC4 0,003 0,003 0,645 9015 9015 MAOA 0,554 0,872 0,447 PGK1 0,061 0,214 0,053 POLA1 0.115 0,387 0,161 Это предварительное исследование сигнатуры искусственного отбора демонстрирует полезность и силу неравновесных демографических моделей для выявления кандидатов «генов одомашнивания» (см. Tenaillon and Tiffin 2008). Более того, этот предварительный скрининг предполагает, что искусственный отбор мог иметь сильное влияние на уровни разнообразия в значительной части генома домашнего кролика (2/16 = 12,5%) в дополнение к общегеномному эффекту узкого места приручения.Будущие исследования, нацеленные на многие гены по всему геному, предоставят мощные средства для идентификации генов, лежащих в основе раннего фенотипического перехода от диких форм к одомашненным. В ряде отличных исследований на одомашненных растениях (Wright et al. 2005; Yamasaki et al. 2005, 2007; Chapman et al. 2008) и совсем недавно на цыплятах (Rubin et al. 2010) с большим успехом использовались аналогичные подходы. . Сходный вклад самцов и самок в генофонд домашних кроликов Чтобы спросить, вносят ли самцы и самки по-разному генофонд домашних кроликов, мы сопоставили количество разнообразия, полученного от французских диких кроликов, между аутосомными и X-сцепленными локусами.Сильная предвзятость в отношении пола, при которой меньшее количество мужчин, чем женщин, генетически участвует в процессе приручения и формирования породы, была предложена для одомашненных видов, таких как лошади (Lindgren et al. 2004; Lau et al. 2009) и собаки (Sundqvist et al. 2006) . Если в момент начала одомашнивания был более высокий вклад самок, то мы должны ожидать относительно большего количества генетического разнообразия, захваченного для Х-хромосомы, по сравнению с аутосомами. Противоположной картины следовало бы ожидать, если бы вклад мужчин был выше. Ни того, ни другого не наблюдалось. Уровни вариации, зафиксированные во время одомашнивания (после исключения как GPC4, так и LUM; дополнительная таблица 5, дополнительный материал онлайн), были одинаковыми и незначительно различались для локусов, находящихся на аутосомах (π DOM / π OCCFR = 65,1% и θ DOM / θ OCCFR = 53,2%) по сравнению с локусами, находящимися на X-хромосоме (π DOM / π OCCFR = 60,0% и θ DOM / θ OCCFR = 60.2%; P > 0,30 в обоих случаях по критерию Манна – Уитни U ). Далее мы сравнили Х-хромосому и аутосомы двумя способами. Во-первых, мы выполнили тест HKA (Hudson et al. 1987), используя расхождение с Lepus . Сравнение полиморфизма и уровней дивергенции между Х-сцепленным и аутосомным локусами не выявило существенной разницы в уровнях разнообразия ( P = 0,81). Во-вторых, мы сравнили мультилокусные оценки k dom между аутосомными и X-сцепленными локусами, используя демографическую модель, описанную выше.Оценка для аутосомных локусов ( k dom = 2,8; два предела поддержки логарифмического правдоподобия = 1,6–10,0) была немного выше, чем для X-сцепленных локусов ( k dom = 1,9; два логарифмических правдоподобия пределы поддержки = 0,6–12,0), однако из-за малого количества генов в каждой категории две оценки имеют широкий 95% доверительный интервал и значительно перекрываются. Таким образом, в этих данных нет свидетельств крайне неравного вклада самцов и самок в генофонд домашних кроликов.Однако мы не можем исключить возможность небольших различий в исходном соотношении полов с этими данными, а также не можем оценить какие-либо потенциальные отклонения в соотношении полов при формировании отдельных пород. Выгодная структура LD для генетического картирования Чтобы охарактеризовать LD как функцию физического расстояния, мы повторно секвенировали семь аутосомных областей для 25 особей каждой из шести пород. Мы повторно секвенировали пять фрагментов на расстояниях 50 т.п.н., 400 т.п.н., 1,2 МБ и 3,2 МБ из фрагмента, изначально выбранного для каждой области.Использование данных полного повторного секвенирования имеет то преимущество, что позволяет избежать ошибок установления в составе SNP в отношении общих аллелей. Путем выборки всего спектра мутаций для каждой породы мы увеличили вероятность выборки маркеров, паттерны LD которых будут репрезентативными для генома в целом. Мы обнаружили в общей сложности 267 SNP и indel-маркеров, и 74,5% имели частоту минорных аллелей 10% по крайней мере в одной породе. Все породы показали уменьшение r 2 с расстоянием ().Внутри пород на расстояниях 50 kb r 2 значения варьировались от 0,48 до 0,70 (среднее значение по породам = 0,59), а на расстояниях 400 kb — от 0,21 до 0,34 (среднее значение по породам = 0,25). Внутри пород среднее расстояние, на котором r 2 равно 0,5 (т.е. «полудлина LD»; Райх и др., 2001), составляло ∼98 kb. У некоторых пород умеренно сильные ассоциации ( r 2 > 0,2) простирались далеко за пределы 1 Mb. Например, в New Zealand White большинство SNP, разделенных на 1200 кб, показали, что r 2 больше 0.3, что согласуется с недавней историей сильного отбора у этого штамма. Примечательно, что LD не снижалась до фоновых уровней у четырех из шести пород (шампанское серебро, английская пятнистость, французская ангора и новозеландская белая) в пределах 3200 kb, рассматриваемых здесь — результаты теста Манна-Уитни U между парами маркеров. дистанция 3200 т.п.н. и пары маркеров, расположенные на разных хромосомах, были значимыми при P <0,001, что указывает на то, что остаточные ассоциации могут сохраняться на очень больших расстояниях у некоторых пород.Учитывая, что породы были выбраны, чтобы отразить основное использование домашних кроликов, общие результаты, вероятно, будут распространены на большинство пород. Путем экстраполяции представленной здесь степени LD на весь геном и допущения порогового значения 0,3 для r 2 , мы прогнозируем, что менее 30 000 равномерно распределенных маркеров должно быть достаточно для эффективного скрининга LD внутри пород кроликов. Графики распада LD внутри и среди домашних пород для семи областей генома. LD измеряли с использованием генотипа r 2 (ось y ) и наносили на график в зависимости от физического расстояния в парах килобаз (ось x ).Сплошные линии представляют логарифмическую линию тренда, соответствующую среднему значению r 2 значений для каждой области и для каждого интервала расстояний. Соответствующее стандартное отклонение показано вертикальными полосами. Пунктирные линии на каждой панели представляют собой средние значения r 2 между несвязанными маркерами. Первые шесть панелей показывают LD внутри пород: шампанское серебро (CS), английская пятнистость (ES), французская ангора (FA), французская лопуха (FL), новозеландская белая (NZ) и Rex (RX).Нижняя панель показывает LD с учетом всех шести пород вместе. Напротив, когда все породы рассматриваются вместе, LD распадается быстрее. Среди пород LD имела «полудлину» ∼20 т.п.н., а на расстоянии 400 т.п.н. r 2 в среднем составляла всего 0,13 (). Тот факт, что мы наблюдали более высокую LD у пород кроликов в сочетании с более низкой LD при объединении разных пород, указывает на низкий общий гаплотип между породами и отражает разделение пород на десятки поколений.Этот важный результат предполагает, что использование нескольких пород и плотного набора маркеров в области ассоциации дает большие надежды для сокращения интервалов в исследованиях мелкомасштабного картирования на кроликах. Такая стратегия была применена с выдающимся успехом у собак (Karlsson et al. 2007; Sutter et al. 2007; Parker et al. 2009) и может помочь преодолеть снижение разрешения, которое является результатом обширного LD у пород кроликов. Более того, кролики особенно подходят для лабораторного выращивания, и сочетание подходов сцепления и картирования LD может помочь увеличить возможности для поиска генов, лежащих в основе сложных признаков (Payseur and Place 2007). Представленные здесь результаты демонстрируют, что домашние кролики обладают значительными генетическими вариациями как внутри породы, так и между породами. Более того, структура этой вариации такова, что LD распространяется на значительные расстояния внутри пород, но быстрее распадается между породами, структура, которая может быть полезной для исследований ассоциативного картирования. Замечательное сегрегация фенотипического разнообразия у домашних кроликов делает этот вид хорошо подходящим для понимания механизмов, лежащих в основе фенотипической диверсификации.Кроме того, расширяющийся список характеристик, представляющих медицинский интерес, также открывает большие перспективы для дальнейшего развития кролика как биомедицинской модели. Наши данные показывают, что этот вид, который был впервые одомашнен во Франции за последние 1500 лет, будет полезным ресурсом для выявления генетических вариантов, которые напрямую влияют на функции как медицинских, так и агрономических характеристик. Широкое применение кроликов в качестве модели болезней человека 1. Пастер, Л. Метод для предотвращения ярости после смерти. Comptes rendus Hebd. Des. séances De. l’Académie Des. Sci. 101 , 765–774 (1885). Google ученый 2. Pinheiro, A. et al. Молекулярные основы генетического разнообразия и эволюции локуса гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (IGHV) у лепорид. Иммуногенетика 63 , 397–408 (2011). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 3. Pinheiro, A. et al. Обзор иммунной системы зайцеобразных и ее генетического разнообразия. Иммуногенетика 68 , 83–107 (2016). CAS PubMed Google ученый 4. Маг, Р. Г., Пинейро, А., Лемос де Матос, А. и Эстевес, П. Дж. Иммунная система зайцеобразных. В: М. Дж. Х. Рэтклифф (ред.). Энциклопедия иммунобиологии. Т. 1, (515–525. Elsevier, Амстердам, Голландия, 2016). Google ученый 5. Буркхолдер Т. Х., Линтон Г. Ф. Р., Хойт Дж. И Янг Р. Кролик как экспериментальная модель. В: М. А. Суков, К. А. Стивенс, Р. П. Уилсон (ред.). Лабораторный кролик, морская свинка, хомяк и другие грызуны. с. 529–560. (Academic Press, Кембридж, Массачусетс, США, 2012). Google ученый 6. Муллейн, К. и Уильямс, М.Модели астмы на животных: повторение или перезагрузка? Biochem. Pharmacol. 87 , 131–139 (2014). CAS PubMed Google ученый 7. Уэбб Д. Р. Животные модели болезней человека: воспаление. Biochem. Pharmacol. 87 , 121–130 (2014). CAS PubMed Google ученый 8. Граур Д., Дюре Л. и Гуи М.Филогенетическое положение отряда зайцеобразных (кролики, зайцы и союзники). Природа 379 , 333–335 (1996). CAS PubMed Google ученый 9. Neves, F. et al. Генетическая характеристика интерлейкинов (IL-1альфа, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IL-12A, IL-12B, IL-15 и IL-18) с соответствующими биологическими ролями в зайцеобразные. Врожденный иммунитет. 21 , 787–801 (2015). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 10. Perkins, H.D., van Leeuwen, B.H., Hardy, C.M. и Kerr, P.J. Полные последовательности кДНК IL-2, IL-4, IL-6 И IL-10 европейского кролика ( Oryctolagus cuniculus ). Цитокин 12 , 555–565 (2000). CAS PubMed Google ученый 11. James, J. et al. Принудительная экспрессия тяжелой цепи альфа-миозина в желудочке кролика приводит к кардиопротекции в кардиомиопатических условиях. Тираж 111 , 2339–2346 (2005). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 12. Zschaler, J., Schlorke, D. & Arnhold, J. Различия в врожденном иммунном ответе между человеком и мышью. Крит. Rev. Immunol. 34 , 433–454 (2014). CAS PubMed Google ученый 13. Вентилятор, Дж.и другие. Модели кроликов для изучения атеросклероза человека: от патофизиологических механизмов к трансляционной медицине. Pharmacol. Ther. 146 , 104–119 (2015). CAS PubMed Google ученый 14. Tian, ​​J. et al. Новая модель атеросклероза у кроликов с использованием повреждения стенок артерий, вызванного хлоридом железа, по оценке оптической когерентной томографии, а также внутрисосудистого ультразвукового исследования и гистологии. J. Biomed. Biotechnol. 2014 , 121867 (2012). Google ученый 15. Хименес-Гарсия, А. и др. Повреждение кишечной стенки при простой кишечной непроходимости у кроликов: иммуномодуляторная роль соматостатина. Гепатогастроэнтерология 51 , 1030–1036 (2004). PubMed Google ученый 16. Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Наваррете Сантос, А. и Дюрантон, В. Кролик как репродуктивная модель для здоровья человека. Репродукция 144 , 1–10 (2012). CAS PubMed Google ученый 17. Mage, R.G. & Rai, G. Модель системной красной волчанки на кроликах, полезная для исследования нервно-психиатрической СКВ. В: Х. Алмоаллин (ред.). Системная красная волчанка. с. 201–217. (InTech –Open Access Publisher, Риека, Хорватия, 2012 г.). Google ученый 18. Desando, G. et al. Внутрисуставная доставка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, снижает прогрессирование остеоартрита на экспериментальной модели кролика. Arthritis Res. Ther. 15 , R22 (2013). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 19. Канг, С. Дж., Гроссниклаус, Х. Э. Кроличья модель ретинобластомы. J. Biomed. Biotechnol. 2011 , 3 (2011). PubMed Google ученый 20. Woodruff-Pak, D. S., Agelan, A. & Del Valle, L. Кроличья модель болезни Альцгеймера: действительна на нейропатологическом, когнитивном и терапевтическом уровнях. J. Alzheimers Dis. 11 , 371–383 (2007). CAS PubMed Google ученый 21. Rhee, K. J. et al. Положительный отбор репертуара периферических В-клеток в лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником. J. Exp. Med. 201 , 55–62 (2005). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 22. Маг, Р. Г., Лэннинг, Д. и Найт, К. Л. Развитие репертуара В-клеток и антител у кроликов: потребность в лимфоидных тканях, ассоциированных с кишечником. Dev. Комп. Иммунол. 30 , 137–153 (2006). CAS PubMed Google ученый 23. Бернетт, Р. К., Хэнли, В. К., Чжай, С. К. и Найт, К. Л. Семейство генов тяжелой цепи IgA у кролика: клонирование и анализ последовательности 13 С альфа-генов. EMBO J. 8 , 4041–4047 (1989). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 24. Аби-Рэчед, Л., Дориги, К., Норман, П.J., Yawata, M. и Parham, P. Эпизоды естественного отбора сформировали взаимодействия IgA-Fc с FcalphaRI и бактериальными белками-ловушками. J. Immunol. 178 , 7943–7954 (2007). CAS PubMed Google ученый 25. Pinheiro, A., Woof, JM, Abi-Rached, L., Parham, P. & Esteves, PJ. Вычислительный анализ эволюционной гонки вооружений между иммунитетом млекопитающих, опосредованным иммуноглобулином A, и его подрывом бактериальными патогенами. . PLoS ONE 8 , e73934 (2013). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 26. Дикс, Д. и Китинг, Г. М. Кроличий антитимоцитарный глобулин (тимоглобулин): обзор его использования в профилактике и лечении острого отторжения почечного аллотрансплантата. Наркотики 69 , 1483–1512 (2009). CAS PubMed Google ученый 27. Flisikowska, T. et al. Эффективное разрушение гена иммуноглобулина и целенаправленная замена у кролика с помощью нуклеаз цинкового пальца. PLoS ONE 6 , e21045 (2011 г.). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 28. Weber, J., Peng, H. & Rader, C. От репертуаров кроличьих антител до кроличьих моноклональных антител. Exp. Мол. Med. 49 , e305 (2017). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 29. Zhang, Y. F. и Ho, M. Гуманизация кроличьих моноклональных антител путем пересадки комбинированных областей, определяющих комплементарность Kabat / IMGT / Paratome: обоснование и примеры. МАБ 9 , 419–429 (2017). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 30. Куммерфельдт, К. Э. Раксибакумаб: потенциальная роль в лечении легочной формы сибирской язвы. Заражение. Устойчивость к наркотикам. 7 , 101–109 (2014). PubMed PubMed Central Google ученый 31. Greig, S. L. Obiltoxaximab: первое глобальное одобрение. Наркотики 76 , 823–830 (2016). CAS PubMed Google ученый 32. Carmo, C., Esteves, PJ, Ferrand, N. & van der Loo, W. Генетическая изменчивость хемокинового рецептора CCR5 у лепорид: изменение во 2-м внеклеточном домене путем преобразования гена с CCR2 в Oryctolagus , но не у видов Sylvilagus и Lepus . Иммуногенетика 58 , 494–501 (2006). CAS PubMed Google ученый 33. Abrantes, J. et al. Общее необычное генетическое изменение хемокинового рецептора типа 5 между Oryctolagus , Bunolagus и Pentalagus . Консерв. Genet 12 , 325–330 (2011). CAS Google ученый 34. Lau, G., Labrecque, J., Metz, M., Vaz, R. & Fricker, S.P. Специфичность к ингибитору CCR5 придается одному аминокислотному остатку ROLE OF ILE198. J. Biol. Chem. 290 , 11041–11051 (2015). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 35. Proost, P. et al. Посттрансляционные модификации влияют на активность хемотаксических белков моноцитов человека MCP-1 и MCP-2: идентификация MCP-2 (6–76) как природного ингибитора хемокинов. J. Immunol. 160 , 4034–4041 (1998). CAS PubMed Google ученый 36. van der Loo, W., Afonso, S., de Matos, AL, Abrantes, J. & Esteves, PJ Псевдогенизация гена хемокина MCP 2 / CCL8 у европейского кролика (род Oryctolagus ), но не у видов Cottontail Rabbit ( Sylvilagus ) и Hare ( Lepus ). BMC Genet. 13 , 72 (2012). PubMed PubMed Central Google ученый 37. van der Loo, W. et al. Адаптивная потеря гена? Отслеживание псевдогенизации хемокина Rabbit CCL8 . J. Mol. Эволюция 83 , 12–25 (2016). Google ученый 38. Abrantes, J., van der Loo, W., Le Pendu, J. & Esteves, P. J. Геморрагическая болезнь кроликов (RHD) и вирус геморрагической болезни кроликов (RHDV): обзор. Вет. Res. 43 , 12 (2012). PubMed PubMed Central Google ученый 39. Керр, П. Дж. Миксоматоз в Австралии и Европе: модель возникающих инфекционных заболеваний. Антивирь. Res. 93 , 387–415 (2012). CAS PubMed Google ученый 40. Kerr, P.J. et al. Вирус миксомы и лепорипоксвирусы: эволюционная парадигма. Вирусы 7 , 1020–1061 (2015). PubMed PubMed Central Google ученый 41. Le Gall-Reculé, G. et al. Обнаружение нового варианта вируса геморрагической болезни кроликов во Франции. Вет. Рек. 168 , 137–138 (2011). PubMed Google ученый 42. Lopes, A. M. et al. Полный геномный анализ нового варианта вируса геморрагической болезни кроликов (RHDVb) выявил множественные события рекомбинации. J. Gen. Virol. 96 , 1309–1319 (2015). CAS PubMed Google ученый 43. Chan, W. M. et al. Вирусы миксомы и осповакцины по-разному связываются с лейкоцитами человека. J. Virol. 87 , 4445–4460 (2013). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 44. Чан В. М. и Макфадден Г. Онколитические поксвирусы. Annu Rev. Virol. 1 , 119–141 (2014). PubMed PubMed Central Google ученый 45. Lilly, C. L. et al. Онколитическая виротерапия ex-vivo с использованием вируса миксомы усиливает множественные аллогенные лейкоциты трансплантата костного мозга для усиления трансплантата по сравнению с опухолью. Мол. Ther. 4 , 31–40 (2017). CAS Google ученый 46. Ruvoën-Clouet, N., Ganière, J. P., André-Fontaine, G., Blanchard, D. & Le Pendu, J. Связывание вируса геморрагической болезни кроликов с антигенами семейства гистокровных ABH. J. Virol. 74 , 11950–11954 (2000). PubMed PubMed Central Google ученый 47. Ahmed, S. M. et al. Глобальная распространенность норовируса в случаях гастроэнтерита: систематический обзор и метаанализ. Lancet Infect.Дис. 14 , 725–730 (2014). PubMed Google ученый 48. Тан, М. и Цзян, X. Антигены гисто-группы крови: общий никч для норовируса и ротавируса. Эксперт. Rev. Mol. Med. 16 , e5 (2014). PubMed Google ученый 49. Ruvöen-Clouet, N., Belliot, G. & Le Pendu, J. Норовирусы и группы гистокрови: влияние генетических полиморфизмов общих хозяев на передачу и эволюцию вирусов. Rev. Med. Virol. 23 , 355–366 (2013). PubMed Google ученый 50. Ле Пенду, Дж., Нистром, К. и Рувоен-Клуэ, Н. Коэволюция «хозяин-патоген» и взаимодействия гликанов. Curr. Opin. Virol. 7 , 88–94 (2014). PubMed Google ученый 51. Nyström, K. et al. Антигены гисто-группы крови действуют как факторы прикрепления вирусной инфекции геморрагической болезни кроликов штамм-зависимым образом. PLoS Pathog. 7 , e1002188 (2011). PubMed PubMed Central Google ученый 52. Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M. & González-Gallego, J. Обзор животных моделей для исследования патогенеза и терапевтических стратегий при острой печеночной недостаточности. World J. Gastroenterol. 15 , 3086–3098 (2009). PubMed PubMed Central Google ученый 53. Vallejo, D. et al. Аутофагический ответ при геморрагической болезни кроликов, животная модель вирусно-индуцированной фульминантной печеночной недостаточности. Вет. Res. 45 , 15 (2014). PubMed PubMed Central Google ученый 54. Tuñón, M. J. et al. Кардиотропин-1 способствует высокой выживаемости кроликов с летальным фульминантным гепатитом вирусного происхождения. J. Virol. 85 , 13124–13132 (2011). PubMed PubMed Central Google ученый 55. Booth, L. et al. AR-12 подавляет множественные шапероны, одновременно стимулируя образование аутофагосом, коллективно предотвращая репликацию вируса. J. Cell Physiol. 231 , 2286–2302 (2016). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 56. Сан-Мигель, Б., Альварес, М., Culebras, J. M., González-Gallego, J. & Tuñón, M. J. N-ацетил-цистеин защищает печень от апоптотической гибели в животной модели молниеносной печеночной недостаточности. Апоптоз 11 , 1945–1957 (2006). CAS PubMed Google ученый 57. Crespo, I. et al. Мелатонин предотвращает снижение активности антиоксидантных ферментов и активирует передачу сигналов фактора 2, связанного с ядерным эритроидом 2, в животной модели молниеносной печеночной недостаточности вирусного происхождения. J. Pineal Res. 49 , 193–200 (2010). CAS PubMed Google ученый 58. Crespo, I. et al. Мелатонин подавляет сигнальный путь сфингозинкиназа 1 / сфингозин-1-фосфат у кроликов с молниеносным гепатитом вирусного происхождения. J. Pineal Res. 61 , 168–176 (2016). CAS PubMed Google ученый 59. Le Gall-Reculé, G. et al. Появление нового лаговируса, связанного с вирусом геморрагической болезни кроликов. Вет. Res. 44 , 81 (2013). PubMed PubMed Central Google ученый 60. Николс, Х. Дж. И Хью, У. Х. Демонстрация Spirochaeta pallida в спинномозговой жидкости. JAMA 60 , 108–110 (1913). Google ученый 61. Магнусон, Х. Дж., Игл, Х. и Флейшман, Р. Минимальный инфекционный инокулят Spirochaeta pallida (штамм Николса) и рассмотрение скорости его размножения in vivo. г. J. Syph. 32 , 1–18 (1948). CAS PubMed Google ученый 62. Тернер Т. Б. и Холландер Д. Х. Биология трепонематозов. . (Всемирная организация здравоохранения, Женева, Швейцария, 1957 г.). Google ученый 63. Селл, С. и Норрис, С. Дж. Биология, патология и иммунология сифилиса. Внутр. Rev. Exp. Патол. 24 , 203–276 (1983). CAS PubMed Google ученый 64. Lithgow, K. V. et al. Определенный кандидат в вакцину от сифилиса подавляет распространение Treponema pallidum подвида pallidum. Нат. Commun. 8 , 14273 (2017). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 65. Фитцджеральд Т. Дж. Экспериментальный врожденный сифилис у кроликов. Банка. J. Microbiol. 31 , 757–762 (1985). CAS PubMed Google ученый 66. Фроберг, М. К., Фицджеральд, Т. Дж., Гамильтон, Т. Р., Гамильтон, Б.& Зараби, М. Патология врожденного сифилиса у кроликов. Заражение. Иммун. 61 , 4743–4749 (1993). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 67. Тантало, Л.С., Люкхарт, С.А. и Марра, К.М. Treponema pallidum Штамм-специфические различия в нейроинвазии и клиническом фенотипе на модели кролика. J. Infect. Дис. 191 , 75–80 (2005). PubMed Google ученый 68. Schell, R.F., LeFrock, J. L., Chan, J. K. & Bagasra, O. Модель сифилитической инфекции на хомяке LSH. Заражение. Иммун. 28 , 909–913 (1980). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 69. Wicher, K., Miller, J. N., Urquhart, A. W. & Wicher, V. Treponema pallidum -иммобилизирующие антитела при экспериментальном сифилисе морских свинок. Заражение. Иммун. 57 , 2900–2902 (1989). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 70. Gueft, B. & Rosahn, P. D. Экспериментальный сифилис мышей, критический обзор литературы. г. J. Syph. 32 , 59–88 (1948). CAS PubMed Google ученый 71. Giacani, L. et al. Антигенная изменчивость Treponema pallidum: разнообразие последовательностей TprK накапливается в ответ на иммунное давление во время экспериментального сифилиса. J. Immunol. 184 , 3822–3829 (2010). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 72. Molini, B.J. et al. Устойчивость к макролидам Treponema pallidum коррелирует с мутациями 23S рДНК в недавно выделенных клинических штаммах. Секс. Трансм. Дис. 43 , 579–583 (2016). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 73. Кэмерон К. Э. и Люкхарт С. А. Текущее состояние разработки вакцины от сифилиса: необходимость, проблемы, перспективы. Вакцина 32 , 1602–1609 (2014). PubMed Google ученый 74. Koch, R. Die aetiologie der tuberkulose. Берл. Клин. Wochenschr. 19 , 221–230 (1882). Google ученый 75. Лурье, М.B. Устойчивость к туберкулезу: экспериментальные исследования естественных и приобретенных защитных механизмов. (издательство Гарвардского университета, Кембридж, Массачусетс, США, 1964). Google ученый 76. Mendez, S. et al. Восприимчивость к туберкулезу: состав туберкулезных гранулем у Thorbecke и аутбредных новозеландских белых кроликов. Вет. Иммунол. Immunopathol. 122 , 167–174 (2008). CAS PubMed Google ученый 77. Каплан Г., Ценова Л. Туберкулез легких у кролика. В: Ф. Дж. Леонг, В. Дартуа, Т. Дик (ред.). Цветной атлас сравнительной гистопатологии туберкулеза легких. с. 107–130. (CRC Press, Бока-Ратон, Флорида, США, 2010 г.). Google ученый 78. Флинн, Дж. Л., Ценова, Л., Иззо, А., Каплан, Г. Экспериментальные модели туберкулеза на животных. В: С. Х. Э. Кауфманн, У. Дж. Бриттон (ред.). Справочник по туберкулезу. с. 389–426. (Wiley-VCH Verlag GmbH & Co, Вайнхайм, Германия, 2008 г.). Google ученый 79. Manabe, Y.C. et al. Аэрозольная кроличья модель латентного туберкулеза, реактивации и воспалительного синдрома восстановления иммунитета. Туберкулез 88 , 187–196 (2008). CAS PubMed Google ученый 80. Liu, X. et al. Создание модели туберкулеза позвоночника на кроликах с использованием штамма Mycobacterium tuberculosis h47Rv. Jpn. J. Infect. Дис. 68 , 89–97 (2015). PubMed Google ученый 81. Суббиан С., Каракусис П. и Каплан Г. Модель микобактериальных заболеваний на кроликах. В: Х. Мукундан, М. А. Чемберс, Р. В. Уотерс, М. Х. Ларсен (ред.). Туберкулез, проказа и микобактериальные болезни человека и животных: многочисленные хозяева микобактерий. с. 402–418. (CABI, Оксфордшир, Великобритания, 2015 г.). Google ученый 82. Ценова Л. и др. Вакцинация БЦЖ обеспечивает плохую защиту от вызванного M. tuberculosis HN878 заболевания центральной нервной системы. Вакцина 25 , 5126–5132 (2007). CAS PubMed Google ученый 83. Данненберг, А. Дж. Кроличья модель туберкулеза. В: Б. Р. Блум (ред.). Туберкулез: патогенез, защита и борьба. с. 149–156. (АСМ Пресс, Вашингтон, округ Колумбия, США, 1994). Google ученый 84. Helke, K. L., Mankowski, J. L. & Manabe, Y. C. Модели кавитации на животных при туберкулезе легких. Туберкулез 86 , 337–348 (2006). PubMed Google ученый 85. Via, L.E. et al. Туберкулезные гранулемы гипоксичны у морских свинок, кроликов и нечеловеческих приматов. Заражение. Иммун. 76 , 2333–2340 (2008). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 86. Manabe, Y.C. et al. Различные штаммы Mycobacterium tuberculosis вызывают различный спектр заболеваний в модели туберкулеза на кроликах. Заражение. Иммун. 71 , 6004–6011 (2003). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 87. Via, L.E. et al. Динамика инфекции и ответ на химиотерапию в модели туберкулеза на кролике с использованием позитронно-эмиссионной томографии [(1) (8) F] 2-фтор-дезокси-D-глюкозы и компьютерной томографии. Антимикробный. Агенты Chemother. 56 , 4391–4402 (2012). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 88. Kjellsson, M.C. et al. Фармакокинетическая оценка проникновения противотуберкулезных агентов в легочные поражения кроликов. Антимикробный. Агенты Chemother. 56 , 446–457 (2012). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 89. Лю П., Цзян, Х., Ли, С., Лин, З. и Цзян, Дж. Определение концентрации и распределения противотуберкулезного лекарственного средства из микросфер с замедленным высвобождением в позвонках модели спинального туберкулеза у кроликов. J. Orthop. Res. 35 , 200–208 (2017). CAS PubMed Google ученый 90. Prideaux, B. et al. Связь между стерилизующей активностью и распространением лекарств при туберкулезе. Нат. Med. 21 , 1223–1227 (2015). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 91. Zumla, A. et al. Терапия инфекционных заболеваний, направленная на хозяина: текущее состояние, недавние успехи и перспективы на будущее. Lancet Infect. Дис. 16 , e47 – e63 (2016). PubMed Google ученый 92. Суббиан, С.и другие. Ингибирование фосфодиэстеразы-4 в сочетании с лечением изониазидом кроликов с туберкулезом легких снижает активацию макрофагов и патологию легких. г. J. Pathol. 179 , 289–301 (2011). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 93. Datta, M. et al. Лечение антисосудистым фактором роста эндотелия нормализует сосудистую сеть туберкулезной гранулемы и улучшает доставку малых молекул. Proc. Natl Acad. Sci. США 112 , 1827–1832 (2015). CAS PubMed Google ученый 94. Данненберг, А. М. Младший. Перспективы клинических и доклинических испытаний новых противотуберкулезных вакцин. Clin. Microbiol. Ред. 23 , 781–794 (2010). PubMed PubMed Central Google ученый 95. Converse, P.J. et al. Легочный туберкулез крупного рогатого скота у кроликов: бактериальная вирулентность, эффекты ингаляционных доз, чувствительность к туберкулину и иммунотерапия Mycobacterium vaccae. Clin. Диаг. Лаборатория. Иммунол. 5 , 871–881 (1998). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 96. Breitburd, F. et al. Иммунизация вирусоподобными частицами из вируса папилломы кролика (CRPV) может защитить от экспериментальной инфекции CRPV. J. Virol. 69 , 3959–3963 (1995). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 97. Christensen, N. D. Модель вируса папилломы кролика (CRPV) для тестирования противовирусных и иммунотерапевтических стратегий. Антивирь. Chem. Chemother. 16 , 355–362 (2005). CAS PubMed Google ученый 98. Ху, Дж., Кладель, Н. М., Балог, К., Баджон, Л. и Кристенсен, Н. Д. Влияние генетических изменений на геном CRPV и их применение для изучения патогенеза in vivo. Вирусология 358 , 384–390 (2007). CAS PubMed Google ученый 99. Maglennon, G. A., McIntosh, P. & Doorbar, J. Устойчивость вирусной ДНК в базальном слое эпителия предлагает модель латентного периода папилломавируса после иммунной регрессии. Вирусология 414 , 153–163 (2011). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 100. Hu, J. et al. Модель HLA-A2.1-трансгенного кролика для изучения иммунитета к папилломавирусной инфекции. J. Immunol. 177 , 8037–8045 (2006). CAS PubMed Google ученый 101. Биениас, П. Д. и Каллен, Б.R. Множественные блоки репликации вируса иммунодефицита человека 1 типа в клетках грызунов. J. Virol. 74 , 9868–9877 (2000). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 102. Коэн, Дж. Построение модели СПИДа на мелких животных, блок за блоком. Наука 293 , 1034–1036 (2001). CAS PubMed Google ученый 103. Keppler, O.T. et al. Прогресс в создании модели трансгенных крыс CD4 / CCR5 человека для заражения de novo вирусом иммунодефицита человека типа 1. J. Exp. Med. 195 , 719–736 (2002). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 104. Michel, N. et al. Экспрессия человеческого циклина Т1 улучшает специфическое для Т-клеток ограничение транскрипции ВИЧ у трансгенных крыс, но этого недостаточно для распространения инфекции прототипных штаммов ВИЧ-1 R5 ex vivo. Ретровирология 6 , 2 (2009). PubMed PubMed Central Google ученый 105. Cutino-Moguel, T. & Fassati, A. Фенотипический рецессивный пост-входной блок в клетках кролика, который приводит к аберрантному перемещению ВИЧ-1. Трафик 7 , 978–992 (2006). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 106. Schaller, T., Hue, S. & Towers, G.J. Активный белок TRIM5 у кроликов указывает на общего противовирусного предка белков TRIM5 млекопитающих. J. Virol. 81 , 11713–11721 (2007). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 107. Терво, Х. М. и Кепплер, О. Т. Высокая естественная проницаемость первичных кроличьих клеток для ВИЧ-1 с дефектом вирионной инфекционности в макрофагах в качестве конечного репликационного барьера. J. Virol. 84 , 12300–12314 (2010). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 108. Goffinet, C. et al. Антагонизм CD317 к ВИЧ-1 является видоспецифичным и включает Vpu-опосредованную протеасомную деградацию фактора рестрикции. Клеточный микроб-хозяин 5 , 285–297 (2009). CAS PubMed Google ученый 109. Ikeda, T. et al. Антиретровирусная активность дезаминазы APOBEC1 мелких видов животных. Nucleic Acids Res. 36 , 6859–6871 (2008). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 110. Zhang, J. X., Diehl, G. E. & Littman, D. R. Снятие прединтеграционного ингибирования и характеристика дополнительных блоков репликации ВИЧ в первичных Т-клетках мыши. PLoS ONE 3 , e2035 (2008 г.). PubMed PubMed Central Google ученый 111. Speck, R. F. et al. Клетки кролика, экспрессирующие человеческий CD4 и человеческий CCR5, обладают высокой проницаемостью для инфицирования вирусом иммунодефицита человека типа 1. J. Virol. 72 , 5728–5734 (1998). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 112. Guo, R. et al. Получение и оценка кроликов и коз, нокаутированных по миостатину, с использованием системы CRISPR / Cas9. Sci. Отчет 6 , 29855 (2016). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 113. Yang, D. et al. Идентификация и характеристика кроличьей ROSA26 в отношении нокаута и стабильной экспрессии репортерного гена. Sci. Отчет 6 , 25161 (2016). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 114. Torrents de la Peña, A. et al. Иммуногенность у кроликов тримеров SOSIP из клад A, B и C, вводимых индивидуально, последовательно или в комбинациях. J. Virol. 92 , JVI.01957–17 (2018). Google ученый 115. Sanders, R. W. et al. ВАКЦИНЫ против ВИЧ-1. Нейтрализующие антитела к ВИЧ-1, индуцированные нативными тримерами оболочки. Наука 349 , aac4223 (2015). PubMed PubMed Central Google ученый 116. Beddows, S. et al. Сравнительное исследование иммуногенности на кроликах дисульфид-стабилизированного, протеолитически расщепленного, растворимого тримерного вируса иммунодефицита человека типа 1gp140, тримерного дефектного по расщеплению gp140 и мономерного gp120. Вирусология 360 , 329–340 (2007). CAS PubMed Google ученый 117. Zhang, P. F. et al. Нейтрализующие антитела против ВИЧ-1 с широкой перекрестной реакцией, индуцированные иммунизацией gp140. Proc. Natl Acad. Sci. Соединенные Штаты Америки. 104 , 10193–10198 (2007). CAS PubMed Google ученый 118. Dong, M. et al. Индукция первичных перекрестно-реактивных антител, нейтрализующих вирус иммунодефицита человека типа 1, у мелких животных с использованием системы экспрессии in vivo, полученной из альфавируса. J. Virol. 77 , 3119–3130 (2003). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 119. Kulp, D. W. et al. Конструирование на основе структуры нативных тримеров оболочки ВИЧ-1 для подавления ненейтрализующих эпитопов и устранения связывания CD4. Нат. Commun. 8 , 1655 (2017). PubMed PubMed Central Google ученый 120. Law, M., Cardoso, R.M., Wilson, I. A. & Burton, D. R. Антигенное и иммуногенное исследование антигенов gp120 с привитыми проксимальной мембраной внешней областью с помощью стратегии иммунизации первичным белком ДНК. J. Virol. 81 , 4272–4285 (2007). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 121. Richmond, J. F. L. et al. Скрининг гликопротеинов Env ВИЧ-1 на способность повышать нейтрализующие антитела с использованием иммунизации ДНК и бустинга рекомбинантным вирусом осповакцины. Вирусология 230 , 265–274 (1997). CAS PubMed Google ученый 122. Lu, S. et al. Иммуногенность ДНК-вакцин, экспрессирующих гликопротеин оболочки вируса иммунодефицита человека типа 1 с делециями в областях V1 / 2 и V3 и без них. AIDS Res. Гм. Ретровир. 14 , 151–155 (1998). CAS PubMed Google ученый 123. Wang, S. et al. Повышенная иммуногенность белка gp120 в сочетании с примированием рекомбинантной ДНК для создания антител, нейтрализующих первичный изолят JR-FL вируса иммунодефицита человека 1 типа. J. Virol. 79 , 7933–7937 (2005). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 124. Vaine, M. et al. Улучшенная индукция антител против ключевых нейтрализующих эпитопов с помощью буст-вакцинации первичным белком gp120 вируса иммунодефицита человека типа 1 по сравнению с вакцинацией только белком gp120. J. Virol. 82 , 7369–7378 (2008). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 125. Vaine, M., Wang, S., Hackett, A., Arthos, J. & Lu, S. Ответы антител, вызванные гомологичной или гетерологичной первичной буст-вакцинацией ДНК и белками, различаются по функциональной активности и авидности. Вакцина 28 , 2999–3007 (2010). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 126. Vaine, M. et al. Два близкородственных антигена Env от одного и того же пациента вызывали разные спектры нейтрализующих антител против гетерологичных изолятов ВИЧ-1. J. Virol. 85 , 4927–4936 (2011). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 127. Chen, Y. et al. Новая платформа кроличьих моноклональных антител для анализа разнообразного репертуара эпитопов антител для создания иммуногена Env ВИЧ-1. J. Virol. 87 , 10232–10243 (2013). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 128. Pan, R. et al. Кроличьи моноклональные антитела против ВИЧ-1, полученные в результате иммунизации, могут имитировать способы связывания антигена антител, полученных от людей, инфицированных ВИЧ-1. J. Virol. 87 , 10221–10231 (2013). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 129. Pan, R. et al. Структурный анализ нового кроличьего моноклонального антитела R53, нацеленного на эпитоп в области C4 gp120 ВИЧ-1, критической для связывания рецептора и корецептора. Emerg. Microb. Заразить. 4 , e44 (2015). CAS Google ученый 130. Лю С., Ван С. и Лу С. Иммунизация ДНК как технологическая платформа для индукции моноклональных антител. Emerg. Microb. Заразить. 5 , e33 (2016). CAS Google ученый 131. Srivastava, R. et al. Бессимптомные эпитопы человека, идентифицированные из тегументного белка вируса простого герпеса vp13 / 14 (ul47), преимущественно вызывают полифункциональные эффекторные клетки памяти cd44high cd62llow cd8 + tem и защищают гуманизированных трансгенных мышей hla-a * 02: 01 от инфекции глазного герпеса. J. Virol. 91 , e01793–16 (2017). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 132. Srivastava, R. et al. CXCL10 / CXCR3-зависимая мобилизация hsv-специфических клеток cd8 + tem и cd8 + trm в инфицированных тканях обеспечивает эффективную защиту от рецидивирующей герпетической инфекции и заболевания. J. Virol. 91 , e00278–17 (2017). PubMed PubMed Central Google ученый 133. Несберн, А. Б. и Бен Мохамед, Л. Дань уважения профессору Стивену Л. Векслеру (1948-2016): человеку и ученому. Curr. Eye Res. 42 , 161–162 (2017). PubMed Google ученый 134. Налбандян А. и др. Активация инфламмасомы NLRP3 связана с валозин-содержащей белковой миопатией. Воспаление 40 , 21–41 (2017). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 135. Хан, А.А. и др. Увеличение числа и функции ВПГ-1-специфичных CD8 + эффекторных Т-клеток памяти и резидентных Т-клеток памяти в латентно инфицированных ганглиях тройничного нерва снижает рецидивирующую инфекцию и заболевание глазным герпесом. J. Immunol. 199 , 186–203 (2017). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 136. Dasgupta, G. & BenMohamed, L. Мышей, а не людей: насколько надежны животные модели для оценки кандидатов в иммунотерапевтические вакцины на основе CD8 (+) — Т-клеточных эпитопов герпеса? Вакцина 29 , 5824–5836 (2011). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 137. Chentoufi, A. A. et al. Новая модель трансгенного кролика HLA (HLA-A * 0201) для доклинической оценки вакцин против глазного герпеса на основе CD8 + Т-клеточного эпитопа человека. J. Immunol. 184 , 2561–2571 (2010). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 138. Srivastava, R. et al. Ген транскрипта, ассоциированного с латентным периодом вируса простого герпеса, связан с более широким репертуаром вирус-специфических истощенных CD8 + Т-клеток, сохраняющихся в ганглиях тройничного нерва латентно инфицированных трансгенных кроликов hla. J. Virol. 90 , 3913–3928 (2016). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 139. Perng, G.C. et al. Большое количество реактивированного вируса в слезах предшествует рецидивирующему стромальному кератиту герпеса у стрессированных кроликов, латентно инфицированных вирусом простого герпеса. Curr. Eye Res. 41 , 284–291 (2016). CAS PubMed Google ученый 140. Jester, J. V. et al. Конфокальный микроскопический анализ модели глаза кролика с высокой частотой рецидивирующего стромального кератита герпеса. Роговица 35 , 81–88 (2016). PubMed PubMed Central Google ученый 141. Шривастава, Р.и другие. Бессимптомные Т-клеточные эпитопы CD8 человека вируса простого герпеса 1 типа защищают от глазного герпеса в модели «гуманизированного» HLA-трансгенного кролика. IOVS 194 , 2232–2248 (2015). CAS Google ученый 142. Srivastava, R. et al. Вакцина на основе бессимптомных CD8 + Т-клеточных эпитопов человека вируса простого герпеса типа 1 защищает от глазного герпеса на «гуманизированной» HLA-трансгенной модели кролика. Инвест.Офтальмол. Vis. Sci. 56 , 4013–4028 (2015). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 143. Khan, A.A. et al. Терапевтическая иммунизация смесью «бессимптомных» эпитопов CD8 + Т-клеток человека, полученных из гликопротеина D вируса простого герпеса 1, снижает спонтанное выделение глаз у латентно инфицированных трансгенных кроликов HLA: связь с низкой частотой локальных PD-1 + TIM-3 + CD8 + исчерпана Т-клетки. J. Virol. 89 , 6619–6632 (2015). CAS PubMed PubMed Central Google ученый Клонирование дает гибридный эмбрион человека и кролика Ученые в Китае впервые применили методы клонирования для создания гибридных эмбрионов, которые содержат смесь ДНК как человека, так и кролика, согласно отчету в научном журнале, возродил тлеющие споры об этике исследований клонирования. Более 100 гибридов, полученных путем слияния клеток кожи человека с кроличьими яйцами, позволили развиваться в лабораторных чашках в течение нескольких дней, прежде чем ученые уничтожили их, чтобы извлечь так называемые эмбриональные стволовые клетки из их внутренних органов. Хотя ученые из Массачусетса ранее смешивали человеческие клетки и коровьи яйца в аналогичной попытке сделать гибридные эмбрионы источником стволовых клеток, эти эксперименты не увенчались успехом. Вчера исследователи выразили надежду, что работа с кроликами приведет к новому и многочисленному источнику эмбриональных стволовых клеток для исследований и, в конечном итоге, для медицинского использования.Но теологи и другие осудили эту работу как неэтичную. Некоторые задавались вопросом вслух, что именно было бы такое существо, если бы оно было перенесено в утробу, чтобы развиться до срока. Подавляющее большинство ДНК эмбрионов — человеческое, с небольшим процентом генетического материала, называемого митохондриальной ДНК, внесенной яйцом кролика. Никто не знает, может ли такой эмбрион развиться в жизнеспособный плод, хотя некоторые эксперименты с другими видами предполагают, что это не так. Конгресс годами обдумывал закон, который поставил бы вне закона определенные эксперименты по клонированию человека, при этом некоторые выступали против любого создания клонированных эмбрионов для исследований, а другие поддерживали исследовательское использование до тех пор, пока из эмбрионов не разрешается превращаться в клонированных младенцев.Однако ни один закон не был принят, отчасти из-за предупреждений исследователей о том, что предлагаемые ограничения настолько далеко идущие, что они затруднят разработку новых медицинских методов лечения. Новая работа, проведенная Хуэй Чжэнь Шэном из Второго Шанхайского медицинского университета, опубликована в последнем выпуске Cell Research и освещена в новостях журнала Nature. Cell Research — это рецензируемый, хотя и малоизвестный в Соединенных Штатах научный журнал, выходящий раз в два месяца при Шанхайском институте клеточной биологии и Китайской академии наук.Некоторые исследователи вчера заявили, что разочарованы отсутствием подробностей в статье. Команда заявила, что в качестве источника клеток кожи извлекла ткань крайней плоти у двух 5-летних мальчиков и двух мужчин, а также ткань лица у 60-летней женщины. Они слили эти клетки с яйцами новозеландских кроликов, из которых была удалена большая часть кроличьей ДНК. Более 400 из этих новых, слитых организмов выросли в ранние эмбрионы, и более 100 дожили до стадии бластоцисты — точки, в которой начинают формироваться желанные стволовые клетки. Этот подход может помочь ученым, желающим производить в массовом порядке человеческие эмбрионы в качестве источников человеческих эмбриональных стволовых клеток. Стволовые клетки могут трансформироваться во все виды тканей и могут обращать вспять эффекты различных дегенеративных заболеваний. Но для создания клонированных эмбрионов ученым нужны как нормальные клетки тела, такие как клетки кожи, так и яйцеклетки, которые обладают уникальной способностью «перепрограммировать» гены в клетках тела и заставлять их вести себя так, как если бы они были клетками эмбриона. Поскольку человеческие яйцеклетки сложно и дорого извлекать из женских яичников, а также поскольку извлечение человеческих яйцеклеток представляет опасность для доноров, ученые хотели знать, могут ли яйца животных также служить.Главный вопрос заключался в том, будут ли остатки митохондриальной ДНК, которые обычно остаются в яйце животного, совместимы с ядерной ДНК, внесенной клеткой человека. Новая работа предполагает, что ответ на этот вопрос положительный, сказали ученые, хотя и с рядом оговорок. Наиболее важно, по словам исследователей, что в статье нет никаких сомнений в том, что стволовые клетки, полученные из гибридных эмбрионов, действительно способны расти в течение длительных периодов времени в лабораторных чашках и что они могут превращаться во все известные виды клеток. Тем не менее, сказал Дуглас Мелтон, клеточный биолог и эксперт по клонированию из Гарвардского университета, эта работа является большим достижением, поскольку она предлагает новую систему для изучения механизмов, с помощью которых яйцеклетки заставляют взрослые клетки действовать эмбрионально. Это может дать глубокое понимание человеческого развития, заживления ран и регенерации тканей. Он отметил, что, хотя это первое создание человеческого «химерного» эмбриона — отсылка к сказочной химере из греческой мифологии, у которой была голова льва, тело козла и хвост змеи — это не первое время, когда ученые смешали человеческие клетки с лабораторными животными.Некоторые мыши, например, были наделены клетками человеческого мозга или частями иммунной системы человека для исследований. Китайская работа, по словам Мелтона, «чрезвычайно интересна, и я надеюсь, что они ее преследуют». Р. Альта Чаро, заместитель декана права и профессор биоэтики Висконсинского университета в Мэдисоне, отметил, что работа прошла согласование с китайскими властями по этике, которые, среди прочего, потребовали, чтобы эмбрионы не попадали в организм. растут более 14 дней. «Не считая помещения одного из этих эмбрионов в тело женщины для развития до срока, я не думаю, что эта работа вредит кому-либо живому», — сказал Чаро. Она сказала, что эксперименты должны вынудить противников исследований по клонированию более четко, чем они имели до сих пор, определить, где именно они проводят черту против клонирования человеческого эмбриона — в сущности: каким человеком должен быть эмбрион, чтобы иметь моральное положение. эти защитники обсуждают эмбрионы? Ричард Дёрфлингер, U.С. Конференция католических епископов, сказал, что он уверен, что эмбрионы человека и кролика были достаточно человечными, чтобы заслуживать защиты. «Я думаю, поскольку вся ядерная ДНК — человеческая, — сказал Дёрфлингер, — мы бы считали это организмом человеческого вида». Прикладные науки | Бесплатный полнотекстовый | Генетические ресурсы кроликов могут предоставить несколько моделей животных для объяснения на генетическом уровне разнообразия релевантных морфологических и физиологических признаков У многих видов мутации в гене одноэкзонного рецептора меланокортина 1 (MC1R) определяют мультиаллельный ряд в расширении ( E) локус (e.г., [32,33,34,35,36]). MC1R кодирует семь трансмембранных рецепторов, связанных с G-белком, которые локализованы в мембране меланоцитов. Меланоциты — это специализированные клетки, вырабатывающие меланин разных типов, которые являются конечными молекулярными продуктами биологического пути, ведущего к пигментации. Этот локус эпистатичен по локусу агути. Следовательно, типы продуцируемого меланина напрямую связаны с аллельной структурой в локусах Extension и Agouti. Классические генетические исследования, проведенные на кроликах, показали, что серия Extension у этого вида определяется пятью аллелями [30,31,37,38 , 39,40].Аллель E D определяет доминирующую черную окраску шерсти и вызван одной делецией в рамке считывания 6 п.н. (c.280_285del6 или аллель D6), которая устраняет две аминокислоты во втором трансмембранном домене [41]. Черный цвет пятен породы Клетчатый Гигант обязан этому аллелю. Аллель E S (сталь) считается более слабой версией E D , даже если он, вероятно, может быть определен той же мутацией, вызывающей E D , поскольку другой вариант MC1R, связанный с этим аллелем, до сих пор не описан. [41].Эффект цвета стального покрытия, связанный с этим аллелем, может быть связан с участием генов-модификаторов или гетерозиготных комбинаций в локусе Extension. Аллель E или E + — это аллель дикого типа, который определяет нормальный серый цвет или нормальное расширение черного. Два гаплотипа дикого типа были описаны в локусе Extension, которые могут определять одинаковый фенотипический эффект [41]. Другая делеция в рамке считывания 6 п.н., фланкированная переходом G> A в 5 ‘(c. [124G> A; 125_130del6]), представляет собой причинную сложную мутацию аллеля e J , которая дает фенотип окраса тигрового окраса японского окраса. [42].Этот аллель определяет мозаичное распределение черной и желтой пигментации и может быть интересной моделью альтернативной фиксации выработки эумеланина и феомеланина в специально предназначенных для этого меланоцитах. Эпигенетические регуляции могут быть вовлечены в определение этого уникального фенотипа окраски шерсти [42]. Две породы имеют характерный окрас шерсти, определяемый гомозиготным состоянием аллеля e J : японская и рейнландская (известная также как триколор) породы. Аллель е J рецессивен по отношению ко всем другим аллелям, описанным выше, но является доминантным или частично доминантным по аллелю е, что определяет нерасширение черного и желто-красного (с белым животом) окраса шерсти [39,42].Аллель e вызван делецией 30 нуклеотидов в рамке считывания (c.304_333del30; ∆30 аллель), которая элиминирует 10 аминокислот первой внеклеточной петли трансмембранного белка MC1R [41]. Модифицированный белок не работает; таким образом, меланоциты гомозиготных e / e кроликов могут продуцировать только феомеланин. Аллель е фиксируется у всех пород кроликов, у которых характерен желтый / красный цвет шерсти (например, бургундский олененок, золотая саксония, новозеландский красный и тюрингский [41]). Серия аллелей в этом локусе у кроликов, вероятно, уникальна, если сравнить по сравнению со всеми другими домашними животными.У кролика все мутантные аллели (доминантные и рецессивные, если они связаны с формами дикого типа) вызваны делециями в рамке считывания, которые устраняют несколько аминокислот в транслируемом белке (рис. 1). У собак, крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, ослов, кур и у нескольких других видов, которые были исследованы на гене MC1R, варианты, влияющие на функцию этого гена, связаны с миссенс-мутациями, мутациями сдвига рамки считывания, бессмысленными мутации или структурные мутации, которые изменяют функцию белка или полностью нарушают ее (например,г., [32,33,34,35,36,43,44,45,46,47,48]). До сих пор только у кошек регистрировались делеции в рамке считывания, определяющие рецессивные феомелановые аллели [49,50], но у этого вида не было описано доминантных делеций в рамке считывания. Особенность встречающихся в природе аллелей у кроликов может дать возможность изучить функцию и эффект микроэлиминирования остатков из первичной структуры MC1R, особенно для доминантного аллеля, что также может быть полезно для понимания роли доменов и аминогруппы. кислотные остатки в этом белке. Пути устойчивого развития: детализация проектов Название устойчивой практики или практики Над- и подземные клеточные системы: альтернативный способ разведения кроликов, Италия Имя основного участника Консорциум мелких производителей Витербо, Италия Типы участников Мелкие животноводы, Семейные фермеры Виды домашнего скота Кролик Животноводческая порода Леприно ди Витербо Страна Италия Агроэкологический регион Умеренный Основная характеристика передовой практики Повышение экологической устойчивости, включая сохранение биоразнообразия, Содействие улучшению здоровья и благополучия животных Ключевые особенности системы животноводства Мелкое / общинное безземельное животноводство Год начала реализации стратегии / управленческих стратегий 2003 Основные методы, применяемые для повышения устойчивости животноводства Содержание кроликов — это старый приусадебный участок в Юго-Западной Европе, который берет свое начало в XVII веке и в настоящее время превратился в коммерческую практику.Тем не менее, содержание нескольких клеток для нужд семьи по-прежнему очень распространено, в основном в сельских семьях. Альтернативный способ содержания кроликов — создание подземной клеточной системы, имитирующей естественное поведение и среду обитания кроликов. Строительство клеток и клеток не требует больших затрат труда и других затрат. Его даже можно интегрировать в существующий ландшафт (на картинке в саду видна зона откорма). Можно приготовить укрытие (клетку), а затем его можно засыпать землей.Если подземная клетка соединяется трубкой с внешней клеткой, кролики могут свободно выбирать, оставаться в клетке или в клетке (или даже в пробирке) в соответствии со своей этологией. Гнездо помещается внутрь клетки, а кормушка и поилка помещаются в клетку. Крышка закрывается мешком из соломы, чтобы избежать нагрева от солнечного излучения (также можно использовать изоляционный материал). Когда открытый грунт зарастает растительностью, температура в подземных камерах комфортна для животных.Крышка позволяет исследовать гнездо и при необходимости очищать камеру. Потребности в уборке также сводятся к минимуму. На самом деле достаточно закрыть кролика в клетке хотя бы на два дня, и он выберет место для сбрасывания фекалий и мочи на решетчатый пол клетки. Пол должен легко сниматься для очистки при необходимости. Это достаточная профилактика кокцидиоза. Таким образом, каждую клетку и клетку можно легко продезинфицировать после каждого цикла воспроизводства. На откорме кролики могут находиться в клетках на улице.Во избежание потепления солому размещают над крышей. Кролики попадают в зону откорма в 35-дневном возрасте и становятся готовыми с 11-й недели, когда живая масса составляет около 2,5 кг. Ключевые воздействия передовой практики на устойчивость системы земледелия Этот альтернативный способ разведения кроликов является эффективным вкладом в доход семьи, даже когда земли в распоряжении очень ограничены. • Требования к земле не очень высоки, поскольку система может быть интегрирована с другими видами землепользования.• Подземные камеры могут быть легко построены фермерами с небольшими затратами. • Система является модульной и может расти со временем в зависимости от работы или денежных пособий фермера. • Оптимальный размер может быть легко установлен, если производитель решит не увеличивать свою ежедневную рабочую нагрузку или в соответствии с рыночными условиями. • Построение альтернативной системы может быть легко изучено, а блоки запускаются с простой имитации. • Система может быть хорошо интегрирована с другими видами землепользования.• Сельская среда очень уважаема. • Порода Леприно Витербо является высокоэффективной, и проблема покупки дорогих гибридов и управления ими устранена. • Достигнут высокий стандарт благополучия животных. • Состояние здоровья улучшается. • Мясо продается как качественное мясо, и за него платят более высокую цену: не менее чем вдвое дороже, чем кролики промышленного производства. Ограничения и возможности, наблюдаемые при внедрении описанных практик Обучение работе по строительству и управлению системой может быть довольно быстрым, и фермеры могут получить совет от Консорциума.Условия рынка могут сдерживать рост производства. Но поскольку система разведения кроликов может быть интегрирована с другими видами деятельности, ландшафт не изменится отрицательно, и на той же территории можно получить удвоенное производство. Система требует интенсивного управления, но благодаря ее простоте в эксплуатации фермер может контролировать рабочую нагрузку. Это означает, что при простой, но эффективной системе содержания кроликов и надлежащем содержании самка может производить в среднем более 100 кг / год. Интеграция кролиководства с другими видами деятельности, такими как разведение уток и выращивание овощей или фруктов, создает эффективную систему с меньшими затратами и более высокой производительностью по сравнению с традиционными видами деятельности.Например, выращивание тыквы над клетками также имеет функцию затенения области, чтобы создать лучшую среду для кроликов. Фекалии кроликов можно использовать как навоз для тыкв. Они также способствуют наличию червей и насекомых, которых можно кормить московских уток в качестве источника белка. Также возможно объединение содержания кроликов с другими видами деятельности по усмотрению фермера. Контакты Алессандро Финци ([электронная почта защищена]) Веб-сайт консорциума: http: // www.consorzioconiglioleprino.it Этот кролик ходит на «руках». Ученые считают, что нашли генетическую причину | Наука В 1935 году французские ветеринары наблюдали кролика с необычной походкой. Иногда при ходьбе или беге кролик sauteur d’Alfort поднимал задние лапы над головой, карабкаясь по земле на передних конечностях, как артист цирка (см. Видео выше). Теперь ученые установили генетическую мутацию, которая, вероятно, вызывает у этой породы странную форму передвижения.Задействованный ген является ключом к разгадке того, как спинной мозг позволяет ходить, прыгать и даже стоять на руках — открытие, которое согласуется с другими исследованиями последнего десятилетия на мышах и лошадях. Вместе исследования дают новую картину, которая может помочь объяснить, как передвигаются все позвоночные, включая человека. Работа может помочь ученым лечить двигательные расстройства человека, такие как болезнь Шарко-Мари-Зуб, заболевание нервной системы, характеризующееся мышечной слабостью, говорит Стефани Кох, нейробиолог из Университетского колледжа Лондона, которая не принимала участия ни в одном из исследований, но видела похожая странная походка у мышей.Результаты исследования «одновременно удивительны и захватывающи». Походка сложная. Левая, правая, передняя и задняя конечности должны двигаться в нужное время. Мышцы должны сокращаться ровно настолько, чтобы правильно сгибать, выпрямлять, поднимать и поворачивать ноги. И тело должно иметь возможность переключаться, скажем, с ходьбы на бег или движения вперед или в сторону в одно мгновение, если чувства обнаруживают опасность или препятствия. Набор нервных клеток в спинном мозге, называемый центральным генератором паттернов, а не мозг, принимает большинство этих решений.Но неясно, как именно, говорит Соня Пайшао, нейробиолог из Института нейробиологии Макса Планка. Исследователям известны нервные клетки, называемые интернейронами, которые передают сенсорную информацию от остального тела двигательным нейронам, контролирующим мышцы, и играют ключевую роль. Несколько команд работали над определением классов интернейронов, часто классифицируемых в зависимости от того, какие гены в них активны. Затем предстоит тяжелая работа по выяснению того, что делают эти нейроны. «Точную природу и функцию соответствующих интернейронов трудно определить», — говорит Абдель Эль Манира, нейробиолог из Каролинского института (KI). Вот где приходит на помощь сотер , или кролик-прыгун. Генетики Лейф Андерссон из Уппсальского университета (UU) и Мигель Карнейро из Университета Порту решили попытаться отследить ДНК, стоящую за странной походкой животного после секвенирования генома кролика. в 2014 году. Они скрестили кроликов-прыгунов с другой породой, чтобы получить животных первого и второго поколения с нормальной или стоячей походкой. Затем исследователи сравнили ДНК пораженных и здоровых кроликов и выявили одну мутацию в гене под названием RORB .Работая с биологом по развитию UU Класом Кулландером, они выяснили, где и когда этот ген был активен. У этих кроликов мутация приводит к тому, что аберрантные версии — а иногда вообще не образуются — белка RORB в определенной группе интернейронов, сообщает сегодня группа ученых в PLOS Genetics . Этот белок является фактором транскрипции, что означает, что он контролирует активность многих других генов. Исследования развития показали, что результатом двух дефектных генов RORB является полное отсутствие интернейронов, а у кроликов с одной копией их на 25% меньше.Эти интернейроны являются тормозящими — они не дают нервным клеткам активироваться — и когда они отсутствуют, кролики слишком сильно напрягают определенные мышцы, поднимая задние лапы сильнее, чем следовало бы. «Я был впечатлен тем, что авторы смогли идентифицировать единственную генную мутацию», — говорит Джереми Дасен, нейробиолог из Нью-Йоркского университета. Поскольку локомоция — такое сложное поведение, он ожидал, что будут задействованы несколько генов и несколько классов интернейронов. Но эта статья подчеркивает, что, как и в модульных домах с независимыми секциями, составляющими жилище, передвижение достигается за счет объединенных усилий отдельных классов интернейронов, добавляет он. RORB , по-видимому, также контролирует координацию задних конечностей у мышей: грызуны, у которых отсутствует функциональный ген RORB , плывут, как утки. В результате, говорит нейробиолог Стен Гриллнер, «важность RORB , скорее всего, применима ко всем животным с конечностями», включая человека. Люди с болезнью Шарко-Мари-Тута также имеют атипичные белки RORB. RORB — второй ген, который команда Андерссона определила как важный для походки. В 2012 году он и его коллеги связали мутацию в белке DMRT3, который помогает исследователям идентифицировать подмножество интернейронов, с необычной походкой, называемой toelt.У исландских лошадей с пальцами задние конечности поддерживают больший вес, чем передние, что делает походку более плавной. Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт