Как отрезать гвл: как пилить гипсоволокно в домашних условиях

как пилить гипсоволокно в домашних условиях

При отделочных работах часто используют гипсоволокнистый лист, или ГВЛ. Этот материал создали намного позже гипсокартона, поэтому такой широкой популярности, как ГКЛ, он не завоевал. Однако благодаря специальному составу эти плиты обладают выдающимися прочностными и противопожарными характеристиками с показателями намного выше, чем у гипсокартона. Поэтому ГВЛ незаменим при устройстве насыпных полов, черновой отделке стен и потолков, а так же при возведении всевозможных коробов. Единственный вопрос, который возникает при работе с этим стройматериалом, – чем резать ГВЛ от «Knauf».

Преимущества ГВЛ

Чтобы ответить на наш вопрос, нужно разобраться, что же собой представляет этот материал. Гипсоволокнистые листы, как и гипсокартон, производятся из строительного гипса. Но на этом сходство заканчивается. Основными особенностями ГВЛ являются:

1. Армирование распущенной целлюлозой.
2. Полная однородность материала.
3. Отсутствие покрытия сверху.
4. Негорючесть.
5. Высокая плотность.

Выпуском этого стройматериала занимаются многие производители, но наиболее популярен изготовленный компанией «Кнауф» ГВЛ под названием «Суперлист». Если продолжить сравнение гипсоволокна с гипсокартоном той же фирмы, то видно, что они идеально дополняют друг друга. И использование этих материалов при отделочных работах одновременно пойдет ремонту только на пользу.

Несмотря на то что из ГВЛ можно выполнить любой короб, а стены будут прочными и  невозгораемыми, тем не менее этот материал невозможно гнуть, как гипсокартон. А значит, для монтажа сложных конструкций с закругленными формами он не подойдет.

Зато на полу, в сухих стяжках с керамзитом (технология «КНАУФ-суперпол»), гипсоволокнистые листы не имеют себе равных. Использование их при строительстве чернового пола даст гарантированно положительные результаты. Элементы пола, склеенные из двух листов ГВЛВ общей толщиной 20 мм, имеют следующие полезные свойства:

• Они не ломаются.
• Не пропускают холод.
• Создают идеально ровную поверхность.
• Влагостойкие гипсоволокнистые плиты выдерживают влажность до 70 %.

Инструменты, необходимые для работ с ГВЛ

Многие, кто самостоятельно готовился к монтажу и устанавливал гипсокартон, ошибочно полагают, что аналогичным образом работают и с ГВЛ. Но здесь их ждет неприятный сюрприз. Гипсоволокнистые листы при всех своих прочностных качествах, когда их берешь на излом, оказываются хрупкими и легко ломаются. Кстати, поэтому их и невозможно согнуть, как гипсокартон.

Инструменты, которыми выполняется раскрой листов гипсоволокна в домашних условиях:

• Острый строительный нож толщиной от 12 мм. Лезвия придется часто менять, так как они быстро тупятся.
• Специальная ножовка для ГКЛ, которой можно почти без пыли пилить этот материал.

Некоторые умельцы утверждают, что кроить ГВЛ удобно специальным резаком, каким пользуются сапожники.

• Болгарка или циркулярная пила применяется только в хорошо проветриваемом помещении и при условии, что цель оправдывает средства. Это самый быстрый способ и одновременно очень пыльный. Если решено выбрать этот инструмент, придется запастись средствами защиты дыхательных путей и глаз.
• Идеально подойдет электролобзик со встроенным пылесосом, если в него установить пилку по дереву с шагом зубьев 4 мм. Но пыли все равно будет много, поэтому работать следует в защитных очках и респираторе.

Процесс резки гипсоволокна

При любом способе распила следует помнить об аккуратности и осторожности при обращении с гипсоволокнистыми плитами. Если для проведения работ решено использовать резаки или специальную ножовку, то дальше нужно действовать так:

• На листе ГВЛ делаем необходимую разметку.
• К линии разметки прикладываем ровную рейку. Можно также использовать правило.
• Проводим ножом столько раз, сколько необходимо, чтобы глубина надреза составила не менее 2/3 толщины листа.
• Подкладываем рейку под линию надреза.
• Резким движением вверх аккуратно надламываем.

Прежде чем произвести раскрой, лучше дополнительно посмотреть видео о том, как правильно разрезать лист.

У ГВЛ ровные кромочные края и проблем со стыковкой обычно не бывает. Но если по ряду причин появляется необходимость небольшой подгонки, то для этой цели подойдет обдирочный рубанок.

А вот фальц делать удобнее всего сапожным ножом-резаком или стамеской. При большом объеме можно применить фрезер. Пазовая фреза в 3–4 мм позволит за 2–3 прохода выполнить нужные работы.

Чем и как резать ГВЛ в домашних условиях ☛ Советы Строителей На DomoStr0y.ru

Содержание

Гипсоволокнитый лист или ГВЛ активно применяется при производстве работ, связанных с отделкой. Этот материал был создан позже гипсокартона, поэтому не сумел пока стать настолько популярным. Гипсоволокнистые листы обладают особым составом, который обеспечивает для них совершенно новые характеристики прочности и стойкости к возгоранию, превышающие ГКЛ в несколько раз. ГВЛ считается незаменимым материалом при создании насыпных полов, первоначальной отделке стен, потолков, а также в процессе сооружения разнообразных коробов.

В процессе работы с таким ценным материалом встает только один важный вопрос – чем резать ГВЛ?

Особенности гипсоволокнистых листов

Чтобы разобраться в том, чем и как следует разрезать гипсоволокно, необходимо сначала разобраться в сути самого этого материала. Производство гипсоволокнистых листов, как и гипсокартона, осуществляется из строительного гипса, чем и ограничиваются их сходство. Плиты ГВЛВ отличаются такими особенностями:

• В качестве армирующего материала используется распущенная целлюлоза,
• Материал отличается абсолютной однородностью структуры,
• Сверху не используется никакого покрытия,
• Материал совершенно не горючий,
• Плотность материала выше, чем у традиционного гипсокартона.

Этот строительный материал выпускается многими компаниями, но заслужили самую большую востребованность листы, которые изготавливаются компанией Кнауф. Если взять для сравнения гипсокартонные и гипсоволоконные листы этой фирмы, то можно понять, насколько идеальным дополнением друг к другу они являются, а при их использовании в качестве отделочных материалов в процессе ремонта можно получить только положительный эффект.

При том, что ГВЛ представляет собой отличный материал для выполнения любого короба, а стены окажутся крепкими и практически невозгораемыми, этот материал отличается тем, что его нельзя гнуть аналогично гипсокартону. Получается, что он не подходит для монтажа конструкций, имеющих закругленные формы и сложные элементы.

Применение гипсоволокнистого листа целесообразно на полу, в сухих стяжках, где имеется керамзит, где они проявляют все свои самые лучшие качества. При их использовании в процессе сооружения чернового пола можно получить отличный результат. У элементов пола, получаемых благодаря склеиванию пары листов ГВЛВ общей толщиной 20 мм, наблюдается наличие таких полезных свойств:

• Они устойчивы к нагрузкам, то есть не ломаются в процессе эксплуатации,
• Противодействуют проникновению холода,
• Идеальная гладкость поверхности,
• ГВЛ способны выдерживать влажность до 70%.

Что требуется для работы с ГВЛ?

Обычно умельцы, которые самостоятельно выполняют подготовку и монтаж гипсокартона, считают, что работа с ГВЛ ведется аналогичным образом.

Однако тут их могут поджидать вполне определенные неприятности. При всех имеющихся прочностных характеристиках гипсоволокнистые листы демонстрируют повышенную хрупкость на излом, поэтому легко ломаются при этом. По этой причине ГВЛ листы не гнутся аналогично гипсокартону.

Перед тем, как резать ГВЛ, требуется разобраться, какие для этого подойдут инструменты?

Итак, инструменты, которыми можно разрезать ГВЛ:

• Острый строительный нож, толщина которого составляет не менее 12 мм. Из-за того, что лезвия будут быстро тупиться, их потребуется часто менять.
• Для ГКЛ существует специальная ножовка, при помощи которой можно пилить материал практически без пыли.
• Применение болгарки или циркуляционной пилы целесообразно только в условиях хорошо проветриваемых помещений, если только цель действительно оправдывает средства.
  Это очень шумный и пыльный способ, но из всех он является наиболее быстрым. Если вы решили остановить выбор на таком инструменте, то обязательно используйте средства для защиты дыхательных путей и глаз.
• Электролобзик со встроенным пылесосом – это самый идеальный вариант, особенно при использовании пилки по дереву с шагом зубьев 4 мм. Однако пыли и в этом случае образуется довольно много, что требует использования респиратора и защитных очков.

После того, как вы решите, чем пилить ГВЛ, обязательно требуется позаботиться об осторожности и аккуратности при работе с указанными материалами. При использовании специальной ножовки или резака для работы рекомендуется действовать следующим образом:

• Лист ГВЛ размечается так, как его требуется разрезать,
• Линия разметки используется для того, чтобы приложить к ней правило или ровную линейку,
• Ножом требуется провести по листу столько раз, чтобы на нем сформировалась борозда глубиной не менее 2/3 от толщины листа,
• Под сформировавшуюся линию разреза следует подложить специальную рейку,
• Далее посредством резкого движения вверх нужно аккуратно надломить лист.

Можно просмотреть соответствующее видео перед тем, как приступить к резке.

Гипсоволоконные листы характеризуются формированием ровных кромочных краев, поэтому обычно не возникает проблем со стыковкой. Если потребуется небольшая подгонка, то можно прибегнуть к помощи обдирочного рубанка. Для получения фальца лучше всего подходит стамеска или сапожный нож-резак. Если объем работ довольно велик, то рекомендуется использовать фрезер. При применении пазовой фрезы с шагом 3-4 мм можно за 2-3 подхода произвести все необходимые работы.

Интересные статьи по теме

Чем резать ГВЛ листы кнауф?

Гвлв чем резать

Преимущества ГВЛ

Чтобы ответить на наш вопрос, нужно разобраться, что же собой представляет этот материал. Гипсоволокнистые листы, как и гипсокартон, производятся из строительного гипса. Но на этом сходство заканчивается. Основными особенностями ГВЛ являются:

1. Армирование распущенной целлюлозой.
2. Полная однородность материала.
3. Отсутствие покрытия сверху.
4. Негорючесть.
5. Высокая плотность.

Выпуском этого стройматериала занимаются многие производители, но наиболее популярен изготовленный компанией «Кнауф» ГВЛ под названием «Суперлист». Если продолжить сравнение гипсоволокна с гипсокартоном той же фирмы, то видно, что они идеально дополняют друг друга. И использование этих материалов при отделочных работах одновременно пойдет ремонту только на пользу.

Несмотря на то что из ГВЛ можно выполнить любой короб, а стены будут прочными и невозгораемыми, тем не менее этот материал невозможно гнуть, как гипсокартон. А значит, для монтажа сложных конструкций с закругленными формами он не подойдет.

Зато на полу, в сухих стяжках с керамзитом (технология «КНАУФ-суперпол»), гипсоволокнистые листы не имеют себе равных. Использование их при строительстве чернового пола даст гарантированно положительные результаты. Элементы пола, склеенные из двух листов ГВЛВ общей толщиной 20 мм, имеют следующие полезные свойства:

• Они не ломаются.
• Не пропускают холод.
• Создают идеально ровную поверхность.
• Влагостойкие гипсоволокнистые плиты выдерживают влажность до 70 %.

Инструменты, необходимые для работ с ГВЛ

Многие, кто самостоятельно готовился к монтажу и устанавливал гипсокартон, ошибочно полагают, что аналогичным образом работают и с ГВЛ. Но здесь их ждет неприятный сюрприз. Гипсоволокнистые листы при всех своих прочностных качествах, когда их берешь на излом, оказываются хрупкими и легко ломаются. Кстати, поэтому их и невозможно согнуть, как гипсокартон.

Инструменты, которыми выполняется раскрой листов гипсоволокна в домашних условиях:

• Острый строительный нож толщиной от 12 мм. Лезвия придется часто менять, так как они быстро тупятся.
• Специальная ножовка для ГКЛ, которой можно почти без пыли пилить этот материал.

Некоторые умельцы утверждают, что кроить ГВЛ удобно специальным резаком, каким пользуются сапожники.

• Болгарка или циркулярная пила применяется только в хорошо проветриваемом помещении и при условии, что цель оправдывает средства. Это самый быстрый способ и одновременно очень пыльный. Если решено выбрать этот инструмент, придется запастись средствами защиты дыхательных путей и глаз.
• Идеально подойдет электролобзик со встроенным пылесосом, если в него установить пилку по дереву с шагом зубьев 4 мм. Но пыли все равно будет много, поэтому работать следует в защитных очках и респираторе.

Процесс резки гипсоволокна

При любом способе распила следует помнить об аккуратности и осторожности при обращении с гипсоволокнистыми плитами. Если для проведения работ решено использовать резаки или специальную ножовку, то дальше нужно действовать так:

• На листе ГВЛ делаем необходимую разметку.
• К линии разметки прикладываем ровную рейку. Можно также использовать правило.
• Проводим ножом столько раз, сколько необходимо, чтобы глубина надреза составила не менее 2/3 толщины листа.
• Подкладываем рейку под линию надреза.
• Резким движением вверх аккуратно надламываем.

Прежде чем произвести раскрой, лучше дополнительно посмотреть видео о том, как правильно разрезать лист.

У ГВЛ ровные кромочные края и проблем со стыковкой обычно не бывает. Но если по ряду причин появляется необходимость небольшой подгонки, то для этой цели подойдет обдирочный рубанок.

А вот фальц делать удобнее всего сапожным ножом-резаком или стамеской. При большом объеме можно применить фрезер. Пазовая фреза в 3–4 мм позволит за 2–3 прохода выполнить нужные работы.

Источник: https://mr-build.ru/materiali/chem-rezat-gvl.html

Чем резать ГВЛ листы в домашних условиях: раскрой гипсоволокна (видео)

Чем резать ГВЛ листы в домашних условиях: раскрой гипсоволокна (видео)

Работа с любым отделочным материалом предполагает наличие знаний о его правильной обработке. Это позволяет избежать серьезных проблем, которые могут затянуть облицовочные процессы и привести к порче продукции. Ввиду возрастающей популярности, необходимо учитывать особенности гипсоволокнистых плит. Наибольшие трудности может вызвать подрезка листов, процедура имеет свои нюансы.

Что представляет собой материал

ГВЛ – это сокращенное название гипсоволоконной или гипсоволокнистой плиты (оба варианта правильные).

Она часто сравнивается с гипсокартоном, но, в отличие от него, имеет высокие эксплуатационные характеристики, поскольку не оклеена картоном с обеих сторон.

Согласно технологии, до 80% смеси составляет гипс, остальное – распущенное волокно целлюлозы, которую получают из бумаги. Нужная форма и единая структура получается за счет прессования.

Обратите внимание

Ввиду того что при изготовлении в состав продукции не добавляются связующие химические вещества, материал получается полностью безопасным для здоровья. К тому же листы обладают гигроскопичностью, что позволяет поддерживать в комнате определенный микроклимат: при высокой влажности плита впитывает излишки, а при низкой отдает.

Плотность гипсоволоконного листа значительно выше, чем у ГКЛ, поэтому резка материала требует особого подхода

Выделяют два основных вида продукции: стандартные листы ГВЛ и ГВЛВ (влагостойкий материал, который получается путем добавления в смесь гидрофобных веществ).

Гипсоволокно имеет высокую прочность, поэтому распилить его труднее, чем гипсокартон. Но, в отличие от ГКЛ, ГВЛ не обладает такой пластичностью и не способен изгибаться. Это нужно учитывать, чтобы отрезать изделие правильно и без повреждений.

Выбор инструмента для раскроя плит

К обработке гипсоволокнистой плиты следует подходить ответственно и подбирать режущие приспособления с особой тщательностью. Если найти оптимальный вариант, то процесс не займет много времени.

Перечень инструментов для использования в домашних условиях:

• Ножовка, разработанная для работы с таким материалом. Снабжена зубьями особой формы, расположенными под определенным углом. Это дает возможность пилить плиты без большого количества пыли.Тонкий гипсоволоконный лист можно разрезать стандартной ручной ножовкой для гипсокартона, для более толстого материала необходим специальный инструмент, к примеру, отлично подходят ножовки для пено- и газобетона
• Строительный нож с острым и крепким лезвием. Резка таким инструментом потребует намного больше времени и усилий: листы довольно хрупкие на изгиб, поэтому линию разлома необходимо выделять намного сильнее. Применять нож целесообразно, когда не требуется идеально ровный край или нет времени на доработку.Строительные ножи для плотных материалов должны иметь мощную, усиленную рукоятку, но гораздо быстрее и с меньшими трудозатратами подобные изделия распускаются «крюком» с поперечной обратной заточкой
• Болгарка. Это приспособление относится к наиболее эффективным. Позволяет осуществлять распил большого количества материала за короткий срок. Но работы должны проводиться только в отдельном хорошо проветриваемом помещении. Дело в том, что в процессе выделяется много пыли, которая оседает на всех поверхностях и затрудняет мероприятие. Также необходимо подготовить респиратор и защитные очки.Работать болгаркой с алмазным диском или циркулярной пилой удобно, но при роспуске получается слишком много пыли
• Электролобзик. При масштабных работах рекомендуется предусмотреть возможность подключения к пылесосу, который способен улавливать мелкую взвесь. Присутствие простого пылесборника не сможет уберечь от пыли. Работать необходимо в защитной маске и очках. Важно правильно выбрать пилку: хорошо зарекомендовали себя варианты для дерева с небольшим зубцом, но с этим разрешается поэкспериментировать.

Нож для резки ГВЛ. Чем пилить ГВЛ: как резать листы в домашних условиях

При отделочных работах часто используют гипсоволокнистый лист, или ГВЛ. Этот материал создали намного позже гипсокартона, поэтому такой широкой популярности, как ГКЛ, он не завоевал. Однако благодаря специальному составу эти плиты обладают выдающимися прочностными и противопожарными характеристиками с показателями намного выше, чем у гипсокартона. Поэтому ГВЛ незаменим при устройстве насыпных полов, черновой отделке стен и потолков, а так же при возведении всевозможных коробов. Единственный вопрос, который возникает при работе с этим стройматериалом, – чем резать ГВЛ от «Knauf».

Преимущества ГВЛ

Чтобы ответить на наш вопрос, нужно разобраться, что же собой представляет этот материал. , как и гипсокартон, производятся из строительного гипса. Но на этом сходство заканчивается. Основными особенностями ГВЛ являются:

1. Армирование распущенной целлюлозой.
2. Полная однородность материала.
3. Отсутствие покрытия сверху.
4. Негорючесть.
5. Высокая плотность.

Выпуском этого стройматериала занимаются многие производители, но наиболее популярен изготовленный компанией «Кнауф» ГВЛ под названием «Суперлист». Если продолжить сравнение гипсоволокна с гипсокартоном той же фирмы, то видно, что они идеально дополняют друг друга. И использование этих материалов при отделочных работах одновременно пойдет ремонту только на пользу.

Несмотря на то что из ГВЛ можно выполнить любой короб, а стены будут прочными и  невозгораемыми, тем не менее этот материал невозможно гнуть, как гипсокартон. А значит, для монтажа сложных конструкций с закругленными формами он не подойдет.

Зато на полу, в сухих стяжках с керамзитом (технология «КНАУФ-суперпол»), гипсоволокнистые листы не имеют себе равных. Использование их при строительстве чернового пола даст гарантированно положительные результаты. Элементы пола, склеенные из двух листовобщей толщиной 20 мм, имеют следующие полезные свойства:

• Они не ломаются.
• Не пропускают холод.
• Создают идеально ровную поверхность.
• Влагостойкие гипсоволокнистые плиты выдерживают влажность до 70 %.

Инструменты, необходимые для работ с ГВЛ

Многие, кто самостоятельно готовился к монтажу и устанавливал гипсокартон, ошибочно полагают, что аналогичным образом работают и с ГВЛ. Но здесь их ждет неприятный сюрприз. Гипсоволокнистые листы при всех своих прочностных качествах, когда их берешь на излом, оказываются хрупкими и легко ломаются. Кстати, поэтому их и невозможно согнуть, как гипсокартон.

Инструменты, которыми выполняется раскрой листов гипсоволокна в домашних условиях:

• Острый строительный нож толщиной от 12 мм. Лезвия придется часто менять, так как они быстро тупятся.
• Специальная ножовка для ГКЛ, которой можно почти без пыли пилить этот материал.

Некоторые умельцы утверждают, что кроить ГВЛ удобно специальным резаком, каким пользуются сапожники.

• Болгарка или циркулярная пила применяется только в хорошо проветриваемом помещении и при условии, что цель оправдывает средства. Это самый быстрый способ и одновременно очень пыльный. Если решено выбрать этот инструмент, придется запастись средствами защиты дыхательных путей и глаз.
• Идеально подойдетсо встроенным пылесосом, если в него установить пилку по дереву с шагом зубьев 4 мм. Но пыли все равно будет много, поэтому работать следует в защитных очках и респираторе.

Процесс резки гипсоволокна

При любом способе распила следует помнить об аккуратности и осторожности при обращении с гипсоволокнистыми плитами. Если для проведения работ решено использовать резаки или специальную ножовку, то дальше нужно действовать так:

• На листе ГВЛ делаем необходимую разметку.
• К линии разметки прикладываем ровную рейку. Можно также использовать правило.
• Проводим ножом столько раз, сколько необходимо, чтобы глубина надреза составила не менее 2/3 толщины листа.
• Подкладываем рейку под линию надреза.
• Резким движением вверх аккуратно надламываем.

Прежде чем произвести раскрой, лучше дополнительно посмотреть

У ГВЛ ровные кромочные края и проблем со стыковкой обычно не бывает. Но если по ряду причин появляется необходимость небольшой подгонки, то для этой цели подойдет обдирочный рубанок.

А вот фальц делать удобнее всего сапожным ножом-резаком или стамеской. При большом объеме можно применить фрезер. Пазовая фреза в 3–4 мм позволит за 2–3 прохода выполнить нужные работы.

Ниша из ГВЛ. Как сделать нишу из гипсокартона — описание технологического процесса

Ниша – углубление в стене, выполняющее роль декора или мебели — для размещения шкафа, полочки, вазона, скульптуры. Обустраивать её удобно при обшивке стены панельными материалами. К примеру, собрать из листов ГКЛ на каркасе с последующим окрашиванием, оштукатуриванием стены. Как сделать нишу из гипсокартона своими руками, и какой вид может быть у готового стенового декора?

Для чего делают ниши в стенах

Современная отделка использует ниши в качестве функциональных элементов. В них можно не только размещать шкафы и полочки, но также устанавливают различную технику – телеэкраны, звуковые колонки, предметы электронной техники. В них также можно обустроить, расположить ночник.

Ниши часто используют для маскировки выпирающих предметов – к примеру, радиаторов отопления. Или для визуального увеличения небольшого пространства. Узкие вертикальные углубления в стене «приподнимают» потолки, а направленные горизонтально выемки – «расширяют» комнаты.

Поэтому их обустройство часто используется в небольших помещениях, однокомнатных квартирах, хрущёвках. Также выемки в стенах часто делают в тех помещениях, где должно быть минимум мебели – коридорах,.

На заметку: в одной и той же комнате можно удачно сочетать различные варианты гипсокартонной отделки – ниши, арки и колонны из гипсокартона.

↑

Формы и размеры

Ниша – углубление, которое может иметь различную форму, размеры и дополнительный декор. Как она может выглядеть:

• Форма – может быть прямоугольной, квадратной, с арочным сводом. Она может быть расположенная вертикально или горизонтально. Возможна необычная форма – скруглённая, с кривыми линиями.
• Форма углубления – может быть ступенькой с прямым углом между боковой поверхностью и стеной. Или можно обустроить в стене округлую выемку.
• Возможно наличие освещения в виде встроенных светильников – точечных светодиодных ламп.
• Возможно наличие другого электрооборудования — розеток, выключателей, если планируется поставить в нише телевизор, домашний кинотеатр, музыкальный центр, звуковые колонки.
• Возможно наличие дверей по бокам – такие углубления в стене называют закрытыми нишами. Углубления без дверей называются открытыми.

↑

Инструменты и материалы

Для обустройства ниши в стене с помощью листов ГКЛ понадобятся следующие материалы и инструменты:

• Листы гипсокартона – для жилых комнат используют обычный ГКЛ, для кухни – влагостойкие плиты гипсокартона. Влагостойкие панели не отсыревает, а для визуального отличие выпускаются окрашенным в зелёный цвет.
• Алюминиевый профиль – продаётся в различных размерах сечения, с длиной до 4 м. Для обустройства стен из гипсокартона часто используется профиль с сечением 27х60 мм.
• Крепёжные элементы: пластиковые дюбеля с металлическими саморезами или дюбель-гвозди — для крепления профилей к стене. Если стена кирпичная или бетонная, берут саморезы длиной 40 мм. Саморезы для крепления профилей между собой – часто берут так называемые «клопы» с резьбой-сверлом длиной 9 мм. Саморезы для крепления ГКЛ – достаточно длины 25 мм, если используется 1 слой гипсокартона.
• Нож для гипсокартона или болгарка, электролобзик, пила-ножовка для разрезания гипсокартонных листов, ножницы по металлу для разрезания профилей.
• Отвёртка, дрель и шуруповёрт – для закручивания винтов и саморезов.
• Уровень или отвес – для измерения горизонталей и вертикалей.
• Линейка, карандаш, рулетка – для определения размеров.
• Лента-серпянка – армирующая лента для заделывания швов, стыков.
• Уголки – для укрепления наружных углов и придания им идеальной гладкой формы.
• Шпатель – для нанесения и разравнивания шпатлёвки.
• Шпаклёвка для гипсокартона – «Старт» и «Финиш».

Монтаж на листы ГВЛ — чем резать, какие саморезы и клей использовать при укладке плитки

Гипсовое волокно – сравнительно новый, но уже завоевавший большую популярность, материал для отделки помещений. Выпускается он в виде листов, характеристики которых схожи с гипсокартонными плитами, но превосходят их по многим показателям. В состав гипсоволокнистого листа (ГВЛ) входит строительный гипс, армированный распущенной целлюлозой, которую «добывают» из обычной макулатуры. Сегодня этот материал менее известен, чем его старший собрат – гипсокартон, так как стоит он несколько дороже своего аналога.

Особенности листов ГВЛ

Гипсоволокно обладает рядом уникальных характеристик, недоступных большинству строительно-отделочных материалов:

• Простой монтаж. Выполнение ремонтно-отделочных работ с использованием гипсового волокна исключает применение трудоемких «мокрых» технологий.
• Структура. В отличие от гипсокартона, листы (плиты) ГВЛ имеют однородную структуру с отсутствием внешней оболочки. Этим преимуществом обусловлена повышенная прочность гипсоволокна, ее способность выдерживать предельную нагрузку.
• Экологическая безопасность. Гипсоволокно – экологически чистый продукт, уровень его естественного излучения в 3 раза ниже, чем у кирпича.
• Морозостойкость. Материал может выдержать 15 циклов замораживания-размораживания, тогда как гипсокартон уже после 4 начинает крошиться и трескаться. Таким образом, листы ГВЛ можно применять в отделке не отапливаемых помещений (чердаков, подвалов, гаражей).
• Звукоизоляция. Гипсовое волокно отлично изолирует помещение от постороннего шума. Его характеристики звукоизоляции могут достигать 35 дБ.
• Влагостойкость. Использование гипсоволокнистых плит в помещениях с высоким уровнем влажности (ванных, кухнях) предусматривает применение их особого вида, имеющего повышенную влагостойкость – ГВЛВ.
• Стойкость к воздействию открытого огня. Благодаря абсолютной негорючести материала, монтаж ГВЛ рекомендован для помещений со специальными требованиями пожарной безопасности.

К содержанию↑

Применение

Плиты из гипсоволокна могут использоваться при обшивке стен или полов, обустройстве подвесных потолков, межкомнатных перегородок, создании декоративных конструкций и звукопоглощающих экранов. Гипсоволокнистые листы также могут служить в качестве огнезащитного покрытия помещений с нормальным режимом влажности.

Наряду с применением плит ГВЛ для отделки стен и потолков, этот материал часто используют при монтаже сухой стяжки пола. Поверх него можно укладывать любое финишное покрытие – прочное гипсоволокно обеспечит абсолютно ровную, надежную поверхность. Для выполнения таких работ совсем необязательно нанимать профессионалов, листы можно уложить самостоятельно и очень быстро.

К содержанию↑

Варианты монтажа ГВЛ

Установка гипсоволокнистых плит, хоть и не требуют применения особых навыков, должны выполняться строго поэтапно, именно соблюдение определенного порядка действий обеспечит нужные эксплуатационные характеристики конструкции. Отделку поверхности можно начинать только после проведения всех подготовительных работ, включающих в себя ее очистку, выравнивание, устранение дефектов и грунтовку.

Монтаж ГВЛ для стен, пола или потолка отличается своими характерными особенностями. К примеру, укладка сухого варианта стяжки существенно поднимет уровень пола, из-за чего потребуется подпиливать дверной проем. Если мы собираемся класть плиты прямо на деревянный пол, следует надежно закрепить его элементы и удалить все подгнившие детали.

Первый способ монтажных работ заключается в следующем: нужно укладывать листы  гипсоволокна на специальный клей, используя в качестве крепежа саморезы для  ГВЛ. Крепим плиты по периметру, соблюдая такую технологию: толщина материала – до 12,5 мм, длина самонарезающих шурупов – 40 мм, шаг – 400 мм. Шляпки саморезов необходимо утапливать вглубь на 1,5–2,5 мм.

Вторым вариантом монтажа является каркасный метод. Для выполнения этого вида работ необходимы только самые распространенные инструменты и материалы:

• отвес, уровень, отбивочный шнур;
• дрель, болгарка, шуруповерт;
• дюбели, саморезы по ГВЛ и металлу.

Обрешетку конструкции можно выполнить из деревянного бруса, но лучшим материалом для ее изготовления считается металлический оцинкованный профиль – он более надежен и долговечен. Каркас нужно собрать таким образом, чтобы его элементы находились на расстоянии не более 400 мм друг от друга.

Проводя монтажные работы, многие начинающие умельцы задают вопрос: чем лучше резать ГВЛ? Есть несколько вариантов решения этой проблемы, все зависит от ваших возможностей и предпочтений. Некоторые мастера рекомендуют резать лист ножом, другие используют циркулярную пилу или болгарку. Мы считаем, что лучшим выходом из такой ситуации станет использование электролобзика с встроенным пылесосом – его работа исключает образование большого количества пыли.

Важно помнить – используя первый (бескаркасный) метод облицовки поверхности, необходимо соблюдать определенную ширину зазора между плитами (6–8 мм), заделывать стыки особой гипсовой шпаклевкой и применять специальный клей для ГВЛ.

К содержанию↑

Финишная отделка

В качестве материалов для финишной отделки покрытия можно использовать любые виды обоев, краску или кафельную плитку. Поговорим о плиточной облицовке. Вначале нужно определить поэтапную схему выполнения работ, которая должна состоять из обработки и разметки поверхности, подготовки плитки и клеевого состава, собственно укладки, а также последующей затирки швов.

Плитка для пола и стен имеет разные характеристики и подбирается с учетом индивидуальных особенностей поверхности!

• Перед укладкой плитки на ГВЛ требуется обработать листы особой грунтовкой и дождаться ее высыхания.
• Нужно определить необходимое количество кафеля исходя из длины и ширины отделываемой поверхности. Зная размер изделий с учетом ширины швов, можно рассчитать их общее количество.
• Теперь следует нанести на поверхность клеевой состав, распределяя его равномерным слоем с помощью шпателя.
• Укладывая плитку на ГВЛ, необходимо слегка ее придавливать, чтобы повысить надежность крепления. Многие специалисты советуют применять в этих целях резиновый молоток-киянку.
• Следует оставлять одинаковые зазоры между кафелем, тщательно очищая их от клеевой массы. Через сутки (при облицовке стен) или 48 часов (пола) швы между плитками необходимо затереть, используя специальные составы. Все это время в помещении требуется поддерживать минимальный уровень влажности.

Очень важную роль в мероприятиях по облицовке гипсоволокнистого листа играет правильный подбор грунтовки и клеевого состава – именно от них будет зависеть качество крепления плитки.

Известный производитель ГВЛ – компания KNAUF – рекомендует использовать только качественные материалы для финишной отделки и последовательно выполнять все этапы технологического процесса. Немецкие специалисты советуют применять в работе особый фирменный клей для плитки FLIESEN, готовя его небольшими порциями, достаточными для обработки участка поверхности в 1 м2.

На этом все, будем надеяться, что наша статья поможет начинающему домашнему умельцу определиться с вариантом отделки его любимого помещения. Если же нас почтит своим вниманием опытный мастер, то попросим его поделиться своим опытом и рассказать, как лучше резать ГВЛ, чем его можно отделывать, а самое главное – как избежать ошибок при выполнении таких работ.

Автор статьи

Поделись статьей с друзьями:

как распилить гипсоволокнистый суперлист от Кнауф

На чтение 8 мин Просмотров 273 Опубликовано 31.03.2021 Обновлено 10.03.2021

При монтаже гипсоволокнистых панелей площадь стен, потолка, пола заполняют целыми изделиями, но в сложных местах устанавливают детали по размеру участка. Резка ГВЛ листов происходит сложнее, чем плит гипсокартона, т. к. материал обладает повышенной прочностью. Отрезанные кромки, попадающие на внешние углы, защищают угловым профилем или обрабатывают специальным рубанком.

Область применения и особенности резки

Материал устанавливают для выравнивания горизонтальных и вертикальных плоскостей, его применяют в подвалах и цокольных этажах, где есть большая влажность (не выше 70%). На потолки ставят редко из-за большого веса, но в качестве основы под финишную отделку пола и стен применяют часто. Волокнистые панели сочетаются с поверхностями из камня, дерева, кирпича, пористых бетонов и других материалов.

Варианты обшивки ГВЛ и ГВЛВ:

• помещения в жилых домах, где есть пар, влага, но нет прямого попадания водяных струй;
• стены и перегородки в хозяйственных строениях, которые не отапливаются;
• отделка спортивных залов, площадок, где требуется жесткое основание пола и стен;
• обшивка промышленных помещений с повышенным риском воспламенения;
• облицовка чердачных и мансардных этажей;
• устройство оконных и дверных откосов.

Валера

Голос строительного гуру

Задать вопрос

При производстве в гипсовую смесь добавляют целлюлозные распушенные волокна. Армирующие нити придают материалу прочность, поэтому резать ГВЛ труднее, чем гипсокартонные листы. Влагостойкие гипсоволокнистые панели непластичные, поэтому не могут гнуться даже на небольшой радиус. Это свойство учитывают прежде чем пилить ГВЛ листы. Изделие может треснуть, если его неправильно расположить и упереть при раскрое.

Размеры плит:

• 1,5 х 1,0 м, толщина 10 мм;
• 1,2 х 1,2 м, толщина 10 мм;
• 2,5 х 1,2 м, толщина 10 мм;
• 2,5 х 1,2 м, толщина 12,5 мм.

Производители выпускают мелкоразмерные панели, чтобы уменьшить количество отрезанных деталей, но все равно приходится разрезать ГВЛ, чтобы закрыть поверхность.

Проголосовало: 2

Описание материала

Выпускают продукцию, которая создает жесткое покрытие только в сухих помещениях и материал, работающий во влажностных условиях. В обоих случаях панели не разрушаются от солнечного света, атмосферной химии.

Выпускают виды гипсоволокнистых плит:

• ГВЛ — обычный материал, нестойкий против воды;
• ГВЛВ — листы обладают влагозащитными качествами.

Влагостойкий вариант ставят в производственных цехах, где происходят процессы с выбросом влажных паров, при этом допускается санитарная обработка. Введение в гипсовую массу гидрофобных добавок разрешает применение в ванных комнатах, жилых и общественных кухнях.

При нагревании не выделяет в атмосферу вредных компонентов, поэтому безопасен для человека

Быстро монтируется, не требуется ожидание твердения, при установке отсутствует мусор

В помещении обеспечивает комфортный климат, т. к. «дышит» (пропускает пар и воздух)

Обеспечивает дополнительную защиту от внешнего шума

Не требует обязательной поверхностной отделки шпаклевкой и укрепляющей сеткой

Не горит, т. к. на поверхности отсутствует картонная оболочка

Большой вес, по сравнению с гипсокартоном, поэтому требуется надежный каркас

При установке без каркаса требуется качественный гипсовый клей или сухие клеевые смеси на основе цемента

Различие между ГВЛ и ГКЛ

Отделочный материал создали позже гипсокартона, поэтому он лишен его недостатков, но приобрел много достоинств. Первым преимуществом, по сравнению с ГКЛ, является повышенная прочность и более длительный срок эксплуатации в качестве выравнивающего слоя.

Отличия в монтаже и конструкции:

• У гипсокартона есть множество видов скошенных кромок, которые предназначены для заделки швов, но прямых боков не выпускают. У ГВЛ предусмотрены разновидности: ПК — прямые грани и ФК — разновидность фальцевой кромки.
• Листы гипсокартона ставят на каркас без зазоров между ними, а панели ГВЛ размещают с промежутком 5 – 7 мм (для удобства заделки шва).
• Стойки под ГКЛ монтируют с промежутком в 600 мм, а вертикальные элементы обрешетки под гипсоволокнистые плиты — с промежутком 603 мм, чтобы была возможность сформировать зазор между листами.
• При устройстве двухслойного покрытия перегородок гипсокартонные плиты первого и второго яруса крепят в профиль саморезами. ГВЛ допускают фиксировать саморезы не только в стойки, но и в панели предыдущего слоя.
• Гипсокартон не ставят на полы в качестве чернового слоя, т. к. у него недостаточно прочности, а ГВЛ выдерживает эксплуатационные нагрузки в помещении.

При установке влагостойких волокнистых плит между потолком и стеной оставляют монтажный промежуток 5 мм. С полом их стыкуют с зазором в 10 – 12 мм. Шурупы крутят под углом 90°, они заходят на глубину 1 см в профиль.

Устанавливают материал лицевой стороной наружу, ее можно определить по ровной поверхности без шероховатых выступов. На изнанку наносят маркировочное обозначение из букв и цифр. На лице есть разметка для сверления саморезами в виде точек.

Инструменты, необходимые для работ с ГВЛ

У панелей высокая прочность на сжатие, но на изгиб — низкая, поэтому материал относят к хрупким видам. Нужно точно знать правила раскроя, и чем резать гипсоволокнистый лист.

Размечают детали с помощью рулетки и карандаша.

Для резки используют варианты инструментов:

• строительный нож или резак;
• специальная ножовка;
• болгарка;
• циркулярная пила;
• электролобзик.

Нож потребуется острый, поэтому придется часто менять съемные лезвия шириной 12 мм, т. к. они будут тупиться о гипсовую основу. Инструмент используют, если не нужен идеально ровный край или торец будет располагаться под уголком. Ножовка по ГВЛ имеет правильный наклон зубцов и оригинальную заточку, при работе почти не выделяется пыль.

На болгарку устанавливают диск по камню. Инструмент при резке образует много пыли, поэтому необходимо использовать защитные респираторы. Дисковая пила также справится с распилом быстро, но такими электроинструментами лучше работать на улице или в хорошо проветриваемом помещении.

В домашних условиях подходит электрический лобзик с функцией пылесоса, которым можно отрезать ГВЛ без пыли и быстро. В него ставят пилочку по дереву с широкими зубьями 4 мм. Лобзик хорош тем, что можно выполнять не только прямоугольные резы, но и выпиливать фигурные линии, прорезать отверстия в панелях.

Обрезанные торцы зачищают рубанком, на поверхности которого располагается терка с металлическими острыми выступами. При выходе из строя такие терки меняют запасными элементами.

Правила резки плит без сколов

Ножом режут панель за несколько проходов. Последовательные резы делают по намеченной линии до тех пор, пока плита не будет прорезана на 2/3 толщины. После этого подламывают лист, чтобы он разделился на две части.

Перед работой выбирают поверхность, где будет происходить раскрой. Это должна быть площадка с ровной плоскостью. Под намеченную линию подкладывают деревянную рейку толщиной 20 – 25 мм по всей длине реза. Лезвие диска ведут равномерно, не смещаясь с черты, не рекомендуется спешить при работе.

Распиловка гипсоволокнистого суперлиста от Кнауф

Вариант раскроя с помощью ручного инструмента, например, ножа, резака используют чаще всего. Электроинструмент будет пылить. При небольшом объеме работ можно обойтись простыми приспособлениями.

Последовательность работ:

• укладывают лист на ровную плоскость, можно резать верхний лист на упаковке, не снимая его;
• на панели наносят разметку, по линии накладывают правило, хорошо его прижимают;
• по линии с усилием прорезают несколько раз, стараясь равномерно погружать лезвие;
• под линию реза подкладывают брусок;
• край плиты приподнимают, подламывают по линии, разделяя на части.

Если нужно сделать фальц на прямой кромке, используют нож-резак или стамеску. На больших объемах работают фрезером с пазовой фрезой в 4 мм. Для подгонки кусков ГВЛ по месту применяют обдирочный рубанок.

виды ножей и их особенности. Выбор инструмента для раскроя плит

Простота обработки гипсокартона является его неоспоримым достоинством, поскольку для работы с этим материалом используются самые обыкновенные инструменты. При этом даже самую сложную фигуру из гипрока можно вырезать своими руками, и при наличии определенных навыков это займет совсем немного времени.

В статье мы расскажем о наиболее часто используемых инструментах для резки гипсокартона, а также о том, как правильно резать плиты ГКЛ с помощью того или иного приспособления.

Использование ножа по ГКЛ

Чем резать гипсокартон

Ручной инструмент

Как мы уже отмечали, резка листов гипсокартонной обшивки не является трудоемким занятием. И все же для обеспечения наиболее точного соблюдения размеров и получения максимально ровной кромки нужно использовать соответствующий инструмент .

Резать материал можно с помощью таких приспособлений:

Нож для работ по гипсокартону

• Нож по гипсокартону. В принципе, для резки гипсокартона может использоваться любой достаточно острый нож с прямым лезвием, но специалисты предпочитают использовать модели, предназначенные именно для ГКЛ и ГВЛ.
  Такие ножи комплектуются сменными лезвиями трапециевидной формы, а эргономичная рукоятка позволяет выполнять ровный рез даже без использования линейки.

Обратите внимание!
Чем тоньше лезвие ножа, тем легче оно прорезает картонный слой. С другой стороны, тонкие лезвия чаще ломаются и требуют замены.

• Ножовка по гипсокартону. Используется чаще всего для выпиливания отверстий. Полотно такой ножовки делается достаточно узким, что позволяет пропиливать пазы в уже установленной обшивке.
  Качественные модели ножовок имеют мелкие остро заточенные зубья из высокопрочной закаленной стали.

Пила-ножовка с двухсторонним лезвием

• Дисковый резак. Применяется для отрезания от гипсокартонной плиты ровных полос фиксированного размера. Конструкция резака показана на фото, а научиться пользоваться этим приспособлением довольно просто.

Статья по теме: Как выбрать мебель для ванной комнаты

Дисковый резак

Статьи по теме:

• Подъемник для гипсокартона
• Кромочный рубанок для гипсокартона
• Инструмент для гипсокартона

Электроинструмент

В качестве альтернативы ручному инструменту многие мастера, особенно те, кто занимается гипсокартонными работами на профессиональной основе, используют различный электроинструмент.

Чаще всего применяется:

• Электролобзик. Может использоваться как для прямого реза, так и для выпиливания фасонных элементов. Для гипрока применяется стандартный электролобзик с пилкой по дереву или же со специальной пилкой для цементно-стружечных плит.

Пилки для электролобзика

• Сабельная пила. Высокая цена большинства моделей сабельных пил ограничивает их массовое применение, однако такая пила обеспечивает быстрое и ровное распиливание гипсокартона любой толщины.
• Электродрель с кольцевой фрезой. Применяется для проделывания отверстий в ГКЛ, например, для установки розеток или выключателей.

Кольцевая фреза

Дополнительные приспособления

Для максимально качественной обработки материала кроме непосредственно режущего инструмента используются самые разные дополнительные приспособления:

• Рубанок-терка – применяется для выравнивания кромок гипсокартонных плит после обрезки.
• Кромочный рубанок для гипсокартона – обеспечивает снятие фасок с торцов плит ГКЛ, облегчая тем самым расшивку и заделку швов между плитами.

Рубанок для обработки кромки

• Уровень, рулетка и другие измерительные инструменты. Назначение их очевидно – ведь без точного промера даже самым совершенным инструментом невозможно отрезать нужный по размерам фрагмент материала.

Технология резки гипрока

Использование ножа по ГКЛ

Несмотря на все обилие приспособлений для подрезки гипрока по требуемым размерам, чаще всего применяется самый обыкновенный монтажный нож. С его помощью можно легко отделить фрагмент плиты ГКЛ по прямой линии:

• Вначале с помощью рулетки измеряем размеры нужного нам фрагмента гипрока.
• Переносим размеры на лист материала и с помощью карандаша или маркера размечаем его поверхность.
• К намеченным на поверхности листа точкам прикладываем металлическую линейку или достаточно длинный уровень.

Совет!
Для вырезания достаточно длинных полос мастера иногда используют панель стоечного или стартового профиля – главное, чтобы ее поверхность была идеально ровной.

• Прижимаем линейку к поверхности, и проводим вдоль нее ножом, не отрывая руки, т.е. одним движением. Лезвие должно войти примерно на 1/3 толщины ГКЛ, потому нажимать на нож слишком сильно не стоит.
• Вынимаем нож и укладываем гипрок таким образом, чтобы линия отреза была смещена за край стола. Если работу проводим на полу, то под разрез можно положить деревянную планку таким образом, чтобы один край плиты находился на весу.
• Надавливаем ладонью на свободную часть, надламывая плиту по разрезу. Переворачиваем гипсокартон и ножом прорезаем картонный слой с изнаночной стороны.

На чтение 8 мин. Просмотров 83 Опубликовано 05.08.2019

Не зря люди придумали называть ремонт – вторым «пожаром». Реально, это дело довольно хлопотное и занимает кучу времени и финансовых затрат. У профессиональных ремонтных бригад существует немалое количество специального инструмента для проведения ремонтных работ. А если не хватает финансов, для найма целой бригады.

Ножи для резки гипсокартона.

Чаще всего молодые пары, решаются на этот нелегкий труд самостоятельно. На самом деле, это скрепляет союз молодых людей и делает их отношения или брак – крепче. И еще одна шуточная фраза о ремонте – хочешь поругаться с женой, поклей с ней вместе обои. Но достаточно о шутках и перейдем к серьезной теме сегодняшнего разговора – нож для гипсокартона.

Многие разведут руками и скажут – а чем не устраивает канцелярский нож? Да, это довольно неплохой вариант, и о нем тоже будет сказано. Но с точки зрения профессионального строителя, для конкретных целей должно быть конкретное оборудование.

Резку гипсокартона, можно произвести и обычным столовым ножом, но когда объемы немного больше чем выровнять один-два угла, потребуется специальный нож.

Основные требования к инструменту

Конструкции из гипсокартона, очень популярны сегодня. Он является самым распространенным материалом, для выравнивания поверхностей. Или, наоборот, для создания конструкций очень сложной формы. Для этих целей и был придуман специальный нож, который предназначен для облегчения работы с листами гипсокартона. Также с ним экономится время, рез получается идеально ровный и точный. Специальный инструмент содержит в себе, тонкое и прочное лезвие, иначе оно будет гнуться и уходить в сторону при разрезе. Особенный нож для ГКЛ, включает в себя все эти функции, и такова его главная цель.

Виды

На самом деле, выбор не так велик. Единственное, чем они отличаются, это толщиной и шириной лезвий. А также имеются немного конструктивные особенности. Но все они могут справиться с поставленными задачами, по разрезу ГКЛ. Предлагаю рассмотреть каждый вид более подробно.

Малярный (обойный)

Внешне он мало чем отличается от обычного канцелярского ножа. Но он явно больше размерами. Объяснить это довольно просто: ширина лезвия таких ножей начинается от 18 мм.

Обойный нож.

Рассмотрим несколько вариантов:

• сразу лучше предупредить, что нож с лезвием в 18 мм, как правило, с пластмассовой рукоятью, надежностью не «блещет». Если вы планируете работать с небольшим объемом ГКЛ, то может подойти и такой вариант. Высовывать лезвие более 10 мм, не следует, может сломаться от приложенного давления, а иначе просто не прорежет бумагу на гипсокартоне. И со временем, лезвие начинает в пластике, в месте своего упора на ноже, прорезать поверхность и он приходит в непригодность;
• также существуют и усиленные варианты, они включают в себя металлическую направляющую по ходу лезвия. Корпус уже не продавит, и главное придаст жесткости. А само лезвие уже может достигать в ширину 25 мм;
• профессиональные варианты, это уже удел настоящих мастеров, корпус они имеют металлический с прорезинеными вставками. Ширина лезвия, только 25 мм, и толщина уже достигает 0,6 мм. Но и ценовая категория у них уже другая. Соответственно и надежность на высоте.

Определите для себя, с каким объемом вы собираетесь работать. И уже, исходя из этого, принимайте решение по приобретению. Так как три вышеописанных вида, имеют довольно широкий ценовой диапазон.

Специального назначения

Ножи специального назначения, как раз являются именно тем инструментом, который предпочитают профессионалы. Еще его называют – трапециевидный нож. Он изначально приспособлен для работы с гипсокартоном:

• имеет удобную рукоять, все модели прорезиненные;
• лезвие ножа высокой прочности и жесткости;
• в рукояти может быть ниша для сменных лезвий;
• рукоять анатомически удобна.

Специальный нож для гипсокартона.

Такой нож для гипсокартона, вас не подведет и при резе фигурных линий. А некоторые производители снабжают их встроенной рулеткой, что также облегчает работу и увеличивает производительность. И еще к таким ножам относят, складывающиеся модели, которые удобно носить с собой. С виду напоминает широкий складень.

С дисковым лезвием

Довольно интересная конструкция, но если приглядеться и послушать профессионалов, можно сделать вывод, что это один из самых долговечных ножей. Который, в свою очередь, может делать резы абсолютно любой формы. Геометрических препятствий для него не существует. А если им потребуется сделать прямые разрезы, то можно это делать целый день, как робот. Не боится больших приложенных усилий. Высокие нагрузки ему нипочем.

Нож с дисковым лезвием для гипсокартона.

Таким инструментом пользуются не очень часто, но он просто необходим в некоторых ситуациях. К примеру, когда листы ГКЛ уже смонтированы на свое место и появляется необходимость прорезать небольшое отверстие. Минусом является разлохмачивание краев разреза. Сам резак покрыт специальным покрытием, что позволяет ему мягко делать резы и не застревать в прорезях.

Ножовка для гипсокартона.

Такое приспособление имеет главный плюс, в том, что он может делать ровные полосы до 12 см. Он применяется при особых задачах, например для многоуровневых потолков, где нужны длинные и идеально ровные полосы. Обеспечение качественной резки гипсокартона, обеспечивают два небольших диска, которые расположены строго друг напротив друга. Слой бумаги режется одновременно, что и придает идеальную ровность резу. Использовать его довольно просто: нужно выставить направляющую на нужную ширину и установить приспособление на торец листа. Затем плавно провести им от начала до конца ГКЛ. В результате будет длинный, заданной ширины кусок.

Дисковый резак для гипсокартона.

Электроинструменты

В реальности многие мастера, при срочной необходимости, могут прибегнуть к помощи любого электроинструмента под рукой. Если нужна ровная полоса или изогнутая, то можно разметив лист воспользоваться электролобзиком. Нужно только поставить пилу с наименьшим расстоянием зубьев. Отверстия под розетки и встроенные фонари, можно легко сделать с помощью дрели и одетой на нее специальной «коронки». В общем, любой пилюще-режущий электроинструмент подойдет для работы с ГКЛ. Но лучше это делать при острой необходимости, а в идеале воспользоваться тем инструментом, который для этого предназначен.

Электролобзик для гипсокартона.

Это новшество в мире раскроя гипсокартона. Принцип его действия очень похож на дисковый резак. Но только у того инструмента есть ограничения по ширине получаемой полосы, а у blade runner таких преград не существует. Он абсолютно безопасен при эксплуатации, так как рабочие лезвия спрятаны в корпусе самой конструкции.

Лист также размечается и затем устанавливается устройство, как бы впиваясь в ГКЛ, затем сопоставляем направляющую с разметкой. И начинаем двигать приспособление вдоль линии разметки. Рез получается гладким и ровным за счет, двух режущих лезвий с разных сторон. Экономия времени «налицо».

Blade runner для гипсокартона.

• обратит внимание на толщину лезвия, чем оно тоньше, тем рез идеальней, но вероятность излома высока;
• качество металла, из которого сделаны лезвия;
• сам корпус металлический или пластиковый, плюс в пользу металла;
• доступность и наличие запасных материалов.

Если вы приобретаете резак для небольших работ, то и нет смысла переплачивать за профессиональное оборудование. Ну а если вы уже мастер с опытом, то точно знаете, что вам нужно.

Как резать ГКЛ?

Если вам требуется, что-то отрезать, то сто процентов – нужно семь раз это померить. Эта старая истинна, хоть и перефразированная, имеет глубокий и емкий смысл. Поэтому к работе нужно подходить ответственно, а иначе будете бегать в магазин за ГКЛ, или собирать стену, или потолок из кусочков.

Один из способов резки ГКЛ.

Попробуем составить инструкцию:

1. Замеряем нужные отрезки.
2. Переносим все контуры на лист гипсокартона, делаем все необходимые отметки для реза.
3. ЕЩЕ раз замеряем и сверяем линии раскроя на ГКЛ.
4. Для прямых резов используем как линейку, уровень или профиль.
5. Вовремя реза делаем все аккуратно, без рывков, и не отрывая руки.
6. Уложив лист на ровную поверхность резом вниз, делаем небольшой изгиб на себя, гипсокартон хрустнет и изломиться по всему резу.
7. Затем переворачиваем его, и прорезаем с изнаночной стороны.

Вот и все, кусок отрезан. Если потребуется сделать фигурные резы, читайте выше про инструменты, предназначенные для этого. При небольшом опыте и определенной сноровке, эти все пункты вскоре вы будете делать за считаные минуты. Успехов в ремонте!

При отделочных работах, главное, что необходимо помнить – использовать только безопасные и влагостойкие материалы. Гипсоволоконный лист как раз относится к такому роду материалов. Так какие же основные плюсы в работе с ГВЛ, а, главное, чем его резать? Разберемся.

Гипсоволокно отлично подходит для отделочных работ на стенах, полу и даже потолке. К огромному сожаления, гипсоволокно нельзя сгибать, в отличие от гипсокартона, а значит, что использовать его в создании закругленных конструкций – невозможно.

Использование ГВЛ для покрытия пола дает такие плюсы, как:

• утепление. ГВЛ не пропускает холодный воздух;
• из-за прочности материала можно не беспокоится, что гипсоволокно сломается;
• идеально ровная поверхность пола;
• ГВЛ отлично впитывает влагу.

Но работая с гиповолокном в домашних условиях, необходимо всегда иметь при себе специализированные инструменты для резки гипсоволокна.

Инструменты для работы с гипсоволокном

1. Строительный нож для работы с гипсоволоконным листом. Толщина лезвия должна быть не менее 12 мм. Стоит помнить о том, что лезвия при резке будут тупиться достаточно быстро, поэтому и менять их придется достаточно часто.
2. Специальная ножовка для работы с ГВЛ. Плюсом, безусловно, будет то, что при распиле специальной ножовкой, количество пыли и мусора от нее минимальное. Но процесс займет достаточно много времени.
3. Еще один вариант: циркулярная пила. Данный способ возможен при распиле ГВЛ, но не стоит забывать, что пыли и мусора во время работы будет достаточно много. Необходимо защитить дыхательные пути и работать в хорошо проветриваемом помещении или, лучше, на улице.
4. Болгарка. Стоит отметить, что способ, так же, достаточно удобный, но, как и в случае с циркулярной пилой, необходимо позаботиться о том, чтобы помещение имело хорошую циркуляцию воздуха.

Заметим, что способ, в сравнении с ножовкой или ножом, достаточно быстрый.

• Электролобзик со встроенным пылесосом. Многие утверждают, что данный способ является наиболее оптимальным. Количество пыли и мусора, за счет пылесоса, минимальное, а время, затраченное на распил листа, будет максимально коротким.

Прежде всего, стоит отметить, что каждый сам выбирает чем ему резать гипсовоконный лист. В первую очередь необходимо исходить из того, для каких именно работ необходим ГВЛ и в каком помещении проводятся работы.

Ведь если работа будет проходить в частном доме, то можно использовать и болгарку, стоит лишь выйти на свежий воздух и не беспокоиться о том, что все помещение будет завалено мусором, а в воздухе будет летать пыль еще не один день.

Совсем другой расклад должен быть при работе в квартире в многоэтажном доме. Крайне неудобно таскать листы гипсоволокна, к примеру, с 14-го этажа на первый и распиливать его во дворе жилого дома.

Соответственно, исходя из вышенаписанного необходимо выбирать самый оптимальный способ распила ГВЛ.

Гипсоволокнитый лист или ГВЛ активно применяется при производстве работ, связанных с отделкой. Этот материал был создан позже гипсокартона, поэтому не сумел пока стать настолько популярным. Гипсоволокнистые листы обладают особым составом, который обеспечивает для них совершенно новые характеристики прочности и стойкости к возгоранию, превышающие ГКЛ в несколько раз. ГВЛ считается незаменимым материалом при создании насыпных полов, первоначальной отделке стен, потолков, а также в процессе сооружения разнообразных коробов.

В процессе работы с таким ценным материалом встает только один важный вопрос – чем резать ГВЛ?

Особенности гипсоволокнистых листов

Чтобы разобраться в том, чем и как следует разрезать гипсоволокно, необходимо сначала разобраться в сути самого этого материала. Производство гипсоволокнистых листов, как и гипсокартона, осуществляется из строительного гипса, чем и ограничиваются их сходство. Плиты ГВЛВ отличаются такими особенностями:

• В качестве армирующего материала используется распущенная целлюлоза,
• Материал отличается абсолютной однородностью структуры,
• Сверху не используется никакого покрытия,
• Материал совершенно не горючий,
• Плотность материала выше, чем у традиционного гипсокартона.

Этот строительный материал выпускается многими компаниями, но заслужили самую большую востребованность листы, которые изготавливаются компанией Кнауф. Если взять для сравнения гипсокартонные и гипсоволоконные листы этой фирмы, то можно понять, насколько идеальным дополнением друг к другу они являются, а при их использовании в качестве отделочных материалов в процессе ремонта можно получить только положительный эффект.

При том, что ГВЛ представляет собой отличный материал для выполнения любого короба, а стены окажутся крепкими и практически невозгораемыми, этот материал отличается тем, что его нельзя гнуть аналогично гипсокартону. Получается, что он не подходит для монтажа конструкций, имеющих закругленные формы и сложные элементы.

Применение гипсоволокнистого листа целесообразно на полу, в сухих стяжках, где имеется керамзит, где они проявляют все свои самые лучшие качества. При их использовании в процессе сооружения чернового пола можно получить отличный результат. У элементов пола, получаемых благодаря склеиванию пары листов ГВЛВ общей толщиной 20 мм, наблюдается наличие таких полезных свойств:

• Они устойчивы к нагрузкам, то есть не ломаются в процессе эксплуатации,
• Противодействуют проникновению холода,
• Идеальная гладкость поверхности,
• ГВЛ способны выдерживать влажность до 70%.

Что требуется для работы с ГВЛ?

Обычно умельцы, которые самостоятельно выполняют подготовку и монтаж гипсокартона, считают, что работа с ГВЛ ведется аналогичным образом.

Однако тут их могут поджидать вполне определенные неприятности. При всех имеющихся прочностных характеристиках гипсоволокнистые листы демонстрируют повышенную хрупкость на излом, поэтому легко ломаются при этом. По этой причине ГВЛ листы не гнутся аналогично гипсокартону.

Перед тем, как резать ГВЛ, требуется разобраться, какие для этого подойдут инструменты?

Итак, инструменты, которыми можно разрезать ГВЛ:

• Острый строительный нож, толщина которого составляет не менее 12 мм. Из-за того, что лезвия будут быстро тупиться, их потребуется часто менять.
• Для ГКЛ существует специальная ножовка, при помощи которой можно пилить материал практически без пыли.
• Применение болгарки или циркуляционной пилы целесообразно только в условиях хорошо проветриваемых помещений, если только цель действительно оправдывает средства. Это очень шумный и пыльный способ, но из всех он является наиболее быстрым. Если вы решили остановить выбор на таком инструменте, то обязательно используйте средства для защиты дыхательных путей и глаз.
• Электролобзик со встроенным пылесосом – это самый идеальный вариант, особенно при использовании пилки по дереву с шагом зубьев 4 мм. Однако пыли и в этом случае образуется довольно много, что требует использования респиратора и защитных очков.

После того, как вы решите, чем пилить ГВЛ, обязательно требуется позаботиться об осторожности и аккуратности при работе с указанными материалами. При использовании специальной ножовки или резака для работы рекомендуется действовать следующим образом:

• Лист ГВЛ размечается так, как его требуется разрезать,
• Линия разметки используется для того, чтобы приложить к ней правило или ровную линейку,
• Ножом требуется провести по листу столько раз, чтобы на нем сформировалась борозда глубиной не менее 2/3 от толщины листа,
• Под сформировавшуюся линию разреза следует подложить специальную рейку,
• Далее посредством резкого движения вверх нужно аккуратно надломить лист.

Можно просмотреть соответствующее видео перед тем, как приступить к резке.

Гипсоволоконные листы характеризуются формированием ровных кромочных краев, поэтому обычно не возникает проблем со стыковкой. Если потребуется небольшая подгонка, то можно прибегнуть к помощи обдирочного рубанка. Для получения фальца лучше всего подходит стамеска или сапожный нож-резак. Если объем работ довольно велик, то рекомендуется использовать фрезер. При применении пазовой фрезы с шагом 3-4 мм можно за 2-3 подхода произвести все необходимые работы.

Гипсовое волокно – сравнительно новый, но уже завоевавший большую популярность, материал для отделки помещений. Выпускается он в виде листов, характеристики которых схожи с гипсокартонными плитами, но превосходят их по многим показателям. В состав гипсоволокнистого листа (ГВЛ) входит строительный гипс, армированный распущенной целлюлозой, которую «добывают» из обычной макулатуры. Сегодня этот материал менее известен, чем его старший собрат – гипсокартон, так как стоит он несколько дороже своего аналога.

Особенности листов ГВЛ

Гипсоволокно обладает рядом уникальных характеристик, недоступных большинству строительно-отделочных материалов:

Применение

Плиты из гипсоволокна могут использоваться при обшивке стен или полов, обустройстве подвесных потолков, межкомнатных перегородок, создании декоративных конструкций и звукопоглощающих экранов. Гипсоволокнистые листы также могут служить в качестве огнезащитного покрытия помещений с нормальным режимом влажности.

Наряду с применением плит ГВЛ для отделки стен и потолков, этот материал часто используют при монтаже сухой стяжки пола. Поверх него можно укладывать любое финишное покрытие – прочное гипсоволокно обеспечит абсолютно ровную, надежную поверхность. Для выполнения таких работ совсем необязательно нанимать профессионалов, листы можно уложить самостоятельно и очень быстро.

Варианты монтажа ГВЛ

Установка гипсоволокнистых плит, хоть и не требуют применения особых навыков, должны выполняться строго поэтапно, именно соблюдение определенного порядка действий обеспечит нужные эксплуатационные характеристики конструкции. Отделку поверхности можно начинать только после проведения всех подготовительных работ, включающих в себя ее очистку, выравнивание, устранение дефектов и грунтовку.

Монтаж ГВЛ для стен, пола или потолка отличается своими характерными особенностями. К примеру, укладка сухого варианта стяжки существенно поднимет уровень пола, из-за чего потребуется подпиливать дверной проем. Если мы собираемся класть плиты прямо на деревянный пол, следует надежно закрепить его элементы и удалить все подгнившие детали.

Первый способ монтажных работ заключается в следующем: нужно укладывать листы гипсоволокна на специальный клей, используя в качестве крепежа саморезы для ГВЛ. Крепим плиты по периметру, соблюдая такую технологию: толщина материала – до 12,5 мм, длина самонарезающих шурупов – 40 мм, шаг – 400 мм. Шляпки саморезов необходимо утапливать вглубь на 1,5–2,5 мм.

Вторым вариантом монтажа является каркасный метод. Для выполнения этого вида работ необходимы только самые распространенные инструменты и материалы:

• отвес, уровень, отбивочный шнур;
• дрель, болгарка, шуруповерт;
• дюбели, саморезы по ГВЛ и металлу.

Обрешетку конструкции можно выполнить из деревянного бруса, но лучшим материалом для ее изготовления считается металлический оцинкованный профиль – он более надежен и долговечен. Каркас нужно собрать таким образом, чтобы его элементы находились на расстоянии не более 400 мм друг от друга.

Проводя монтажные работы, многие начинающие умельцы задают вопрос: чем лучше резать ГВЛ? Есть несколько вариантов решения этой проблемы, все зависит от ваших возможностей и предпочтений. Некоторые мастера рекомендуют резать лист ножом, другие используют циркулярную пилу или болгарку. Мы считаем, что лучшим выходом из такой ситуации станет использование электролобзика с встроенным пылесосом – его работа исключает образование большого количества пыли.

Важно помнить – используя первый (бескаркасный) метод облицовки поверхности, необходимо соблюдать определенную ширину зазора между плитами (6–8 мм), заделывать стыки особой гипсовой шпаклевкой и применять специальный клей для ГВЛ.

Финишная отделка

В качестве материалов для финишной отделки покрытия можно использовать любые виды обоев, краску или кафельную плитку. Поговорим о плиточной облицовке. Вначале нужно определить поэтапную схему выполнения работ, которая должна состоять из обработки и разметки поверхности, подготовки плитки и клеевого состава, собственно укладки, а также последующей затирки швов.

Плитка для пола и стен имеет разные характеристики и подбирается с учетом индивидуальных особенностей поверхности!

Очень важную роль в мероприятиях по облицовке гипсоволокнистого листа играет правильный подбор грунтовки и клеевого состава – именно от них будет зависеть качество крепления плитки.

Известный производитель ГВЛ – компания KNAUF – рекомендует использовать только качественные материалы для финишной отделки и последовательно выполнять все этапы технологического процесса. Немецкие специалисты советуют применять в работе особый фирменный клей для плитки FLIESEN, готовя его небольшими порциями, достаточными для обработки участка поверхности в 1 м2.

Является ли GVL сегодня вашим первым обязательным к прочтению с утра?

Поскольку времени едва хватает на то, чтобы выпить кофе, отвезти детей в школу, направиться на работу, в спортзал или куда угодно, когда жизнь требует, чтобы мы были ужасно ранними утренними часами, оставаться в курсе того, что происходит в Гринвилле, может оказаться утомительной задачей. Почему тебе должно быть до этого дело? Потому что Гринвилл не только один из самых быстрорастущих городов в стране, но и мы живем здесь, в этом замечательном сообществе, и повседневные события в той или иной степени затрагивают каждого из нас.

Супер-простой способ оставаться в курсе текущих новостей, узнавать погоду, узнавать новое место, где можно побаловать себя своей одержимостью пиццей или убедиться, что вы выглядите умно, обсуждая футбол, — это ежедневная электронная рассылка GVLtoday.

Что такое GVLtoday?

Вы, наверное, слышали об этом. На самом деле это все в моде. GVLtoday был запущен в прошлом году в качестве бесплатного ресурса для сообщества, который прорезает шум и раскрывает суть того, что ежедневно происходит здесь, в Гринвилле, на основе местных источников новостей, в том числе ваших искренних в Kidding Around Greenville и сообщества- сгенерированный контент, такой как опросы и опросы

GVLtoday — это одно из первых, что я читаю утром, и мне требуется меньше пяти минут, чтобы ознакомиться с контентом, который написан с юмором, небольшой шуткой и вниманием к новостям. что вам небезразлично.Макет состоит не из длинных абзацев, а из легко читаемых маркеров, выделенных жирным шрифтом важных данных и соответствующих изображений. Будь то список мест для пожертвований жертвам урагана или лучших мест для покупок на праздники, у GVLtoday есть все это в коротком ежедневном электронном письме.

Издатель GVLtoday Райан Хифи и их мультимедийный продюсер Мэри Уилсон были отчасти достаточно, чтобы ответить на некоторые вопросы KAG о публикации, поэтому после того, как вы ее прочтете, проявите им немного любви и подпишитесь на информационный бюллетень.

Вопросы и ответы с GVLtoday

Шутки в Гринвилле: Спасибо, что нашли время ответить на несколько вопросов! Что самое уникальное в GVLtoday?

GVLtoday (RH): Наиболее уникальной особенностью GVLtoday, вероятно, является наша способность эффективно вовлекать сообщество в темы, которые действительно волнуют наших читателей. Мы сосредоточены на том, чтобы делиться новостями сообщества, событиями и диалогами через социальные каналы, включая не только Facebook и Twitter, но также Instagram, Snapchat и нашу новостную рассылку.Информационный бюллетень и Instagram — наши самые популярные и быстрорастущие платформы. Мы делаем все возможное, чтобы доставлять новости в различных форматах, чтобы охватить наших читателей, которые предпочитают использовать контент. Мы рады быть брендом, который может вводить новшества и расти с постоянно развивающимися технологиями и поддерживать интерес наших читателей.

KAG: Как вы извлекаете свой контент изо дня в день — есть ли у вас люди, которые весь день просто просматривают местные новости? Как узнать, что наиболее актуально для вашей аудитории?

GVLtoday (MW): это определенно большая задача.Но важный! Моя работа как продюсера — быть «профессиональным гуглером». Наш издатель, Райан, постоянно держит руку на пульсе и является отличным ресурсом, и в настоящее время у нас есть два отличных стажера, которые помогают. Затем моя работа — это курировать и комментировать. Я стараюсь, чтобы новости были легкими и интересными для наших читателей.

Я знаю, что наиболее актуально для нашей аудитории, потому что я действительно в курсе того, как они реагируют в социальных сетях, а также общаюсь с самыми разными людьми.

Это личное: чем ваши друзья делятся на Facebook? О чем ваши коллеги говорят в офисе? Это то, что мы покрываем.

КАГ: Очевидно, у нас есть много родителей, которые читают «Шутки в Гринвилле», и город, безусловно, подходит для семей. Стараетесь ли вы регулярно включать новости и мероприятия, которые нравятся этой аудитории?

GVLtoday (RH): Kidding Around Greenville, безусловно, является источником всех новостей и мероприятий для родителей, поэтому мы делаем все возможное, чтобы каждую неделю собирать и делиться историями из KAG, чтобы помочь информировать население, которое, возможно, еще не испытало KAG как ресурс.

Кроме того, мы делаем все возможное, чтобы ежедневно собирать семейный контент в северной части штата. Самое главное, мы стремимся помочь родителям и всем членам общества найти способы познакомиться с Гринвиллом. Для всех важно время от времени избегать детишек и проводить время с друзьями и близкими.

KAG: Не могли бы вы дать нам несколько закулисных секретов того, как начинался GVLtoday? Как быстро он вырос? Сколько у вас подписчиков в ваших социальных сетях?

GVLtoday (RH): GVLtoday родился в семье Community Journals (Greenville Journal, Upstate Business Journal, TOWN Magazine и т. Д.) как желание действительно создать публикацию, написанную для сообщества, для сообщества и о нем в удобном цифровом формате.

Поскольку медиа-ландшафт постоянно меняется, привнесение инноваций в местные СМИ было не только возможностью, но и необходимостью для стимулирования роста. Когда в начале 2016 года издатель Greenville Journal / Upstate Business Journal Райан Джонстон поддержал эту идею, друг и местный предприниматель Райан Хифи изучал новые предприятия. Когда Райан собрался вместе, вскоре в команду был привлечен Райан Хифи, который помогал в разработке и развертывании GVLtoday, запущенного 1 июля 2016 года.

Всего за 5 месяцев бренд вырос до более чем 23 000 подписчиков в социальных сетях и 17 000 подписчиков на ежедневную новостную рассылку. Чтобы подписаться на рассылку новостей, подпишитесь сегодня на gvltoday.com.

KAG: Вы недавно провели несколько опросов и опросов своих читателей. Увидим ли мы это в будущем?

GVLtoday (RH): Определенно, опросы — отличный способ привлечь наших читателей, поучиться у них и увидеть, о чем мы должны больше говорить.В ходе недавнего опроса о развитии центра города мы не только узнали, что волнует людей, но и выяснили, где существуют пробелы в коммуникации в Гринвилле. Прекрасный пример — парковка в центре города. То, что мы узнали, позволяет нам оставлять отзывы городу, но также показывает, что нашим читателям необходимо знать, где найти все недостаточно используемые гаражи и общественный транспорт. Не волнуйтесь, контента так много, что скоро у нас возникнет проблема, посвященная навигации по центру города.

КАГ: Вы черпаете идеи из рассказов своих читателей? Где они могут рассказать вам о своих блестящих мыслях?

GVLtoday (MW): Мы * любим * слышать от наших читателей и стараемся изо всех сил отвечать им ежедневно, отвечая на предложения, отзывы и идеи историй.

Лучший способ всегда оставаться с нами — это социальные сети. Мы в Twitter, Facebook и Instagram на @GVLtoday.

KAG: Гринвилл быстро меняется с новыми застройками по всему району, экономическими возможностями в центре города, повсюду строятся здания — как вы видите свою роль в информировании жителей обо всем?

GVLtoday (MW): Как бесплатная цифровая новостная организация, мы оказываем ценную и важную услугу сообществу.В социальных сетях и в Интернете так много новостей — мы прорезаем все это, чтобы дать Гринвиллианам самое лучшее. Мы делаем город умнее и ближе, экономя время и силы наших читателей. Это действительно беспроигрышный вариант для всех.

Инновационные медиа — моя огромная страсть, и, как продюсеру GVLtoday, действительно удивительно быть на передовой при создании новой публикации.

Мы гибки в том, что можем пробовать много нового, и мы буквально встроены в город (деревню Вест-Гринвилл), так что весь движущий фактор — это действительно участие в диалоге с сообществом.

KAG: Ребята, вы, очевидно, пробуете много разных кофеен, ресторанов, музеев и т. Д. У вас есть любимое место, где можно расслабиться?

GVLtoday (RH): Наша команда действительно смотрит на GVLtoday как на образ жизни, поэтому места, которые мы посещаем, и мероприятия, которые мы посещаем, хотя мы делаем фото в Instagram или документируем профессиональные советы для наших читателей, мы » ты всегда веселишься. Мы бы не выполняли эту работу, если бы познавать Гринвилл было не весело.

Но если уж на то пошло, я уверен, что вся наша команда любит горы и пивоварни.Удачи вам найти нас в походе, но у вас не должно возникнуть проблем с поиском нас у местного водопоя. Приходи и поздоровайся!

У нас есть еще несколько мест, куда мы сбегаем, но мы пока держим их в секрете, так как нам действительно нравится время от времени отдыхать.

KAG: У вас хорошее начало, каковы ваши долгосрочные планы? Куда вы идете отсюда?

GVLtoday (RH): Самая большая новость в начале 2017 года — это запуск нашего нового веб-сайта. Мы внедряем несколько интересных функций, которые, по нашему мнению, принесут огромную пользу нашему сообществу.

Забегая вперед на 2017 год, можно описать его одним словом, это масштаб. Вы поймете, что мы имеем в виду, всего через несколько месяцев. Следите за обновлениями.

Хотите лично проверить GVLtoday?

Вы еще не убедились в регистрации? Давай, сделай это сейчас.

Социальные сети

Найдите GVLtoday на их веб-сайтах, в Instagram, Twitter и Facebook.

Райан Хифи, издатель (Twitter, Instagram)

Мэри Уилсон, продюсер мультимедиа (Twitter, Instagram)

GVLtoday — ваш выбор для всего, что связано с Гринвиллом?

Познакомьтесь с Кристиной, экспертом по кулинарии KAG

Кристина Эрнандес — мама двух девочек, писатель-фрилансер и фотограф, уроженка Нью-Джерси, которая рада назвать Северный округ своим новым домом.Она любит готовить, пробовать новые блюда и проверять все, что может предложить Гринвилл.

Gather GVL: одни арендаторы уезжают, другие присоединяются после годовой годовщины

Когда толпы людей впервые хлынули в концепцию фуд-холла под открытым небом Gather GVL в феврале прошлого года, никто не мог предположить, что одноименное название концепции — «сбор» — будет скоро появится слово, которое напомнит о паранойе общественного здравоохранения.

Сейчас, год спустя, после блокировок COVID-19 и публичных судебных споров из-за договоров аренды между владельцем Gather GVL и его арендаторами, в фуд-холле уходят некоторые арендаторы и появляются новые концепции.

Арендаторы выезжают

West End Coffee , кофейня

Rocky Moo , бутерброды с мороженым

Sweet Sippin , винный бар (переезд в новое торговое место на Огаста-роуд в конце этого года)

Прост! , Немецкая кухня fast-casual

Прост! Владелец Харальд Шмидт сказал, что ему грустно видеть закрытие этой главы, но он планирует «следующее приключение» в будущем.

«Мы празднуем возможность служить сообществу Гринвилля и разделяем со всеми вами нашу любовь к немецкой еде и пиву», — сказал Шмидт в социальных сетях.«Но пора Проста! двигаться вперед в поисках новых начинаний. Это не до свидания, это до встречи! »

Из числа новых арендаторов, присоединяющихся к фуд-холлу:

Myami Bites , кубинско-американская концепция, специализирующаяся на кубанах, эмпанадах и «флюидах миами», согласно ее аккаунту в Instagram. Myami Bites, который займет меньшее «место в инкубаторе», которое в настоящее время занимает The Pasta Addict.

Ресторан Pasta Addict , специализирующийся на домашней итальянской пасте, займет место бывшего ресторана Rocky Moo.

Yolo Pizza Kitchen , новая концепция пиццы от основателя Tacozzina Эми Ринкоски, займет место бывшего Прост! место.

Juice Box , концепция винного бара от владельца Greenville Beer Exchange Девина Кокса, займет место в Sweet Sippin.

Ожидайте, что новые концепты будут открыты этой весной.

Открыт GVL по адресу 126 Augusta St.

границ | Нацеливание на интерлейкин-2-индуцируемую Т-клеточную киназу (ITK) дифференцирует GVL и GVHD в Allo-HSCT

Основные моменты

● Донорские Т-клетки с дефицитом ITK проявляют минимальную GVHD, но поддерживают активность GVL.

● Донорские Т-клетки с дефицитом ITK демонстрируют значительно сниженную продукцию воспалительных цитокинов и миграцию в органы-мишени GVHD.

● Eomes требуется для эффекта GVL.

Введение

Во время трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) аллореактивные донорские Т-клетки необходимы для эффекта трансплантат против лейкемии (GVL) (1–3). Те же донорские Т-клетки могут также вызывать значительное повреждение тканей хозяина, известное как болезнь трансплантат против хозяина (GVHD) (4).Развитие РТПХ приводит к значительной заболеваемости и смертности, что осложняет алло-ТГСК, потенциально излечивающее лечение лейкемии. Стандартная иммуносупрессивная терапия при РТПХ часто терапевтически неоптимальна и предрасполагает пациентов к оппортунистическим инфекциям, таким как цитомегаловирус (ЦМВ), и рецидиву основного злокачественного новообразования (5, 6). Таким образом, необходимо идентифицировать специфические сигнальные пути, которые могут быть нацелены, чтобы позволить эффектам GVL сохраняться при ингибировании GVHD. Нерецепторная тирозинкиназа семейства Tec, интерлейкин-2-индуцибельная Т-клеточная киназа (ITK), регулирует активацию Т-клеток ниже рецептора Т-клеток (TCR).ITK участвует в активации внутриклеточной передачи сигналов кальция и путей MAPK, а также в поляризации актинового цитоскелета, поддерживая неотъемлемую роль ITK в активации и функционировании Т-клеток (7, 8). ITK участвует в передаче сигналов, которая приводит к продукции цитокинов популяциями Т-клеток, а также негативно регулирует развитие отдельной популяции Т-клеток, продуцирующих цитокины врожденного типа, в тимусе (9), называемого фенотипом врожденной памяти (IMP). Т-клетки. Эти клетки экспрессируют значительно более высокие уровни CD122, CD44 и Eomes по сравнению с Т-клетками мышей WT.Поскольку активация, рост, продукция цитокинов и миграция аллореактивных донорских Т-клеток к органам-мишеням являются отличительными признаками РТПХ (10, 11), а ITK участвует в этих действиях Т-клеток, мы исследовали роль ITK в РТПХ и GVL модель алло-ТГСК.

Предыдущие исследования показали, что ибрутиниб, ингибитор родственной киназы Tec тирозинкиназы Bruton (BTK), которая также может ингибировать ITK, способен снижать хроническую GVHD (12). Здесь мы используем мышиную модель алло-HSCT с участием аллотрансплантата Т-клеток от мышей C57Bl / 6 (WT) или мышей Itk ^{— / —} мышам BALB / c для изучения GVHD и GVL.Мы обнаружили, что CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки, трансплантированные от мышей с дефицитом передачи сигналов ITK, индуцируют значительно меньшую РТПХ, сохраняя при этом функцию GVL, по сравнению с Т-клетками от мышей WT. Мы также обнаружили, что это разделение GVHD от GVL не зависело от развития IMP T-клеток, поскольку T-клетки мышей с двойным нокаутом рецептора IL-4 и ITK ( Itk / Il4ra DKO), у которых отсутствует фенотип IMP (13), не индуцировали GVHD, вместо этого присутствие или отсутствие ITK отделяло GVHD от GVL присущим клеткам образом.Более того, Itk ^{— / —} донорские Т-клетки продемонстрировали присущее клетке снижение пролиферации, а донорские Т-клетки CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клетки от Itk ^{— / —} мышей демонстрируют повышенную экспрессию. перфорина и значительно снижает экспрессию провоспалительных цитокинов. И CD4 ⁺ , и CD8 ⁺ Т-клетки от Itk ^{— / —} мышей активируют ключевой фактор транскрипции Eomes, который, как мы обнаружили, имеет решающее значение как для GVHD, так и GVL, поскольку Itk ^{— / —} Eomes ^{flox / flox} CD4cre ⁺ Доноры Т-клеток (дефицитные как по Eomes, так и по ITK) не вызывали цитотоксического ответа против первичных лейкозных клеток или светлых опухолевых клеток, как in vitro, , так и in vivo .Наши данные также демонстрируют, что дефицит ITK влияет на передачу сигналов JAK1 / 2 (14) и IRF-4 (15), а Т-клетки CD4 ⁺ и CD8 ⁺ от ITK-дефицитных мышей обнаруживают дефекты миграции Т-клеток в ткани-мишени GVHD. , вызванный снижением экспрессии хемокиновых рецепторов. Это приводит к уменьшению повреждения тканей во время алло-ТГСК. Itk ^{— / —} Т-клетки могут успешно очищать циркулирующие лейкозные клетки, однако они не могут очищать подкожно растущие лейкозные клетки из-за этого миграционного дефекта.Наконец, данные секвенирования РНК показали, что дефицит ITK влияет на гены, участвующие в продукции цитокинов, клеточной адгезии и экспрессии хемокинов и рецепторов цитокинов. Эти гены участвуют в патогенезе РТПХ. Наши исследования идентифицируют специфическую и новую потенциальную терапевтическую мишень и ее последующий механизм разделения GVHD и GVL после алло-HSCT. Нацеливание на ITK также может оказаться полезным при других заболеваниях, опосредованных Т-клетками.

Материалы и методы

Мыши

Itk ^{— / —} мышей были описаны ранее (16).C57BL / 6, C57BL / 6.SJL (B6-SJL), ROSA26-pCAGGs-LSL-люцифераза, Thy1.1 (B6.PL-Thy1a / CyJ), CD45.1 (B6.SJL-Ptprc ^a Pepc ^b / BoyJ), и мышей BALB / c приобретали в Charles River или Jackson Laboratory. Мыши Eomes ^{flox / flox} , мыши B6.129S1 и мыши CD4cre были приобретены в лаборатории Джексона. Мышей, экспрессирующих Cre, управляемый промотором CMV (CMV-Cre), покупали в лаборатории Джексона и скрещивали с мышами ROSA26-pCAGGs-LSL-люцифераза (B6-luc). Мышей B6-luc скрещивали с мышами Itk ^{— / —} с получением мышей Itk ^{— / —} luc. Itk ^{— / —} / Il4ra ^{— / —} мышей с двойным нокаутом были описаны (13). Использовали мышей в возрасте 8–12 недель, и все эксперименты проводили на мышах того же возраста и пола. Уход за животными и эксперименты проводились в соответствии с правилами и инструкциями, установленными институциональными комитетами по уходу за животными и использованием животных в SUNY Upstate Medical University и Cornell University.

Реагенты, клеточные линии, проточная цитометрия

Моноклональные антитела были приобретены в eBiosciences (Сан-Диего, Калифорния) или BD Biosciences (Сан-Диего, Калифорния).Используемые антитела включали анти-CD3, анти-CD28, анти-CD3-FITC, анти-CD3-BV605, анти-CD8-FITC, анти-BrdU-APC, анти-IFNγ-APC, анти-TNFα-PE, анти-CD45. .1-PerCPCy5.5, анти-CD122-APC, анти-CD44-Тихоокеанский синий, анти-Eomes-PE-Cy7, анти-CD25-BV421, анти-FoxP3-APC, анти-T-bet-BV421, анти- CD4-BV785, анти-CD45.1-Pacific Blue и анти-H-2K ^d -Pacific Blue. Мы выполнили мультиплексный ELISA с использованием наборов Biolegend LEGENDplex, и некоторые наборы были специально заказаны для обнаружения цитокинов как мыши, так и человека. Люциферин был приобретен у Perkin Elmer (Уолтем, Массачусетс) и Gold Bio (Сент-Луис, Миссури).Мертвые клетки исключались из анализа с помощью окрашивания LIVE / DEAD Fixable Aqua Dead Cell. Проточную цитометрию выполняли с использованием цитометра BD LSR-II или BD LSRFortessa (BD Biosciences). Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).

Для сортировки клеток Т-клетки очищали магнитными шариками против CD8 или против CD4 с использованием колонок MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) перед окрашиванием поверхности клеток. Сортировку FACS проводили с помощью сортировщика клеток FACS Aria III (BD Biosciences).Популяции, отсортированные по FACS, обычно имели чистоту> 95%. Антитела против IRF4, STAT3, JAK2, JAK1, GAPDH и β-актина (для общих и / или фосфо-белков) были приобретены в Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Все реагенты и химические вещества для клеточных культур были приобретены у Invitrogen (Гранд-Айленд, Нью-Йорк) и Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури), если не указано иное. Клеточные линии A20 (American Type Culture Collection; Manassas, VA) и первичные бластные клетки B-ALL мыши (17) трансдуцировали люциферазой и культивировали, как описано ранее (18).

Исследования Allo-HSCT и GVL

Летально облученным мышам BALB / c (800 сГр) внутривенно вводили 10 × 10 ⁶ истощенных Т-лимфоцитами клеток костного мозга ( _TCD BM) с или без 1 × 10 ⁶ FACS-отсортированных CD8 ⁺ Т-клеток, 1 × 10 ⁶ CD4 ⁺ Т-клеток или CD8 / CD4-клеток, смешанных в соотношении 1: 1. Использовали FACS-отсортированные общие CD8 ⁺ , общие CD4 ⁺ или смешанные донорские CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток от WT (C57Bl / 6) или Itk ^{— / —} мышей.Для экспериментов с GVL первичные бласты B-клеточного острого лимфобластного лейкоза (B-ALL) (17), трансдуцированные люциферазой, культивировали, как описано ранее (18), и использовали 2 × 10 ⁵ экспрессирующих люциферазу бластов B-ALL. Мышей оценивали дважды в неделю с момента инъекции лейкозных клеток в течение 65 дней с помощью биолюминесцентной визуализации с использованием системы визуализации IVIS 50 (Xenogen), как описано ранее (19). Клиническое состояние мышей оценивали 2–3 раза в неделю с помощью системы баллов, которая суммирует изменения пяти клинических параметров: потеря веса, осанка, активность, текстура шерсти и целостность кожи (20).Мышей умерщвляли, когда они теряли ≥30% от первоначальной массы тела или становились умирающими.

Для экспериментов с химерой клетки костного мозга мышей Itk ^{— / —} (CD45.1 ⁺ ) или C57Bl / 6 (CD45.2 ⁺ ) смешивали в различных соотношениях — 1: 1 (WT : Itk ^{— / —} ), 1: 2, 1: 3 или 1: 4 — и трансплантировали смертельно облученным мышам Thy1.1. В некоторых экспериментах мы использовали Itk ^{— / —} на фоне CD45.2 и WT на CD45.1 фон, как указано в подписях к рисункам. Через 9 недель у мышей брали кровь из хвостовой вены для определения присутствия , Itk, , ^{— / —} и клеток WT. Для экспериментов по оценке GVHD Itk ^{— / —} (CD45.1 ⁺ ) и WT (CD45.2) Т-клетки были отсортированы с помощью FACS от хозяев Thy1.1 и затем трансплантированы облученным мышам BALB / c, несущим лейкоз. клеток вместе с _TCD BM, как описано выше. Затем был проведен анализ РТПХ и РТПХ. В некоторых экспериментах FACS-сортированные CD8 ⁺ Т-клетки от мышей WT или Itk ^{— / —} смешивали в соотношении 1: 1 и вводили мышам BALB / c (2 × 10 ⁶ CD8 ⁺ Всего Т-лимфоцитов).

Визуализация тканей

Allo-HSCT выполняли с 10 × 10 ⁶ WT-истощенных Т-клетками ВМ и 1 × 10 ⁶ FACS-сортированных CD8 ⁺ или 1 × 10 ⁶ FACS-сортированных CD4 ⁺ Т-клеток (от B6-luc или Itk ^{— / —} luc мышей) и биолюминесцентную визуализацию тканей выполняли, как описано ранее (21). Вкратце, через 5 минут после инъекции люциферина (10 мкг / г веса тела) отобранные ткани были подготовлены и визуализированы в течение 5 минут.Данные визуализации были проанализированы и количественно определены с помощью программного обеспечения Living Image (Xenogen) и Igor Pro (Wave Metrics, Lake Oswego, OR).

Анализы продукции цитокинов, цитотоксичности и включения BrdU

На 7-й день после трансплантации получали сывороточные и одноклеточные суспензии селезенки. Содержание в сыворотке IL-33, IL-1α, IFN-γ, TNF-α и IL-17A определяли с помощью множественных цитокиновых анализов (Biolegend LEGENDplex). Т-клетки стимулировали анти-CD3 / анти-CD28 в течение 4-6 часов в присутствии брефельдина А (10 мкМ) и окрашивали внутриклеточно на цитокины (IFN-γ и TNF-α).Контрольные клетки стимулировали PMA и иономицином в присутствии брефельдина A.

Анализы пролиферации

Для обнаружения BrdU мышам давали BrdU с начальным болюсом BrdU (2 мг на 200 мкл внутрибрюшинно) и питьевой водой, содержащей BrdU ( 1 мг / мл) в течение 2 дней. Включение BrDU проводили с использованием набора BrDU (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализы цитотоксичности

Для анализов цитотоксичности экспрессирующие люциферазу клетки А20 высевали в 96-луночные планшеты с плоским дном в концентрации 3 × 10 ⁵ клеток / мл.В каждую лунку добавляли калиевую соль люциферина D-светлячка (75 мкг / мл; Caliper Hopkinton, MA) и измеряли биолюминесценцию с помощью системы визуализации IVIS 50. Затем были добавлены эффекторные клетки ex vivo (отсортированные по MACS или FACS CD8 ⁺ Т-клетки от мышей с трансплантированным костным мозгом) в соотношении 40: 1, 10: 1 и 5: 1 эффектор-мишень (E: T) и инкубировали при 37 ° C в течение 4 часов. Затем измеряли биолюминесценцию в относительных единицах люциферазы (RLU) в течение 1 мин. Клетки, обработанные 1% Nonidet P-40, использовали как меру максимального уничтожения.Клетки-мишени, инкубированные без эффекторных клеток, использовали для измерения спонтанной гибели. Три лунки усредняли, и процент лизиса рассчитывали на основе данных с использованием следующего уравнения:% специфического лизиса = 100 × (RLU спонтанной смерти — тест RLU) / (RLU спонтанной смерти — максимальное уничтожение RLU) (22).

Анализ миграции

Летально облученным мышам BALB / c внутривенно вводили 10 × 10 ⁶ WT _TCD ВМ-клеток от B6.PL- Thy1 ^a / CyJ мышей вместе с FACS-сортированными CD8 ⁺ или CD4 ⁺ Т-клетки из B6.SJL и Itk ^{— / —} мышей, смешанных в соотношении 1: 1 (WT: Itk ^{— / —} ). Через семь дней после трансплантации мышей умерщвляли и выделяли лимфоциты из печени, тонкой кишки, селезенки и лимфатических узлов, дренирующих кожу. Печень перфузировали PBS, диссоциировали и фильтровали через фильтр 70 мкм. Тонкий кишечник промывали средой, встряхивали в стрип-буфере при 37 ° C в течение 30 минут для удаления эпителиальных клеток, а затем промывали перед расщеплением коллагеназой D (100 мг / мл) и ДНКазой (1 мг / мл) в течение 30 минут. мин при 37 ° C с последующей фильтрацией через фильтр 70 мкм.Лимфоциты из печени и кишечника дополнительно обогащали с использованием 40% градиента Перколла. Клетки анализировали на h3K ^b , CD45.1 ⁺ и CD45.2 ⁺ CD8 ⁺ Т-клетки с помощью проточной цитометрии, но мы исключили любые Т-клетки костного мозга (Thy1.1 ⁺ ).

РНК, секвенирование

Т-клеток из WT C57Bl / 6 или Itk ^{— / —} мышей очищали MACS и отсортировывали по FACS, и 2 × 10 ⁶ FACS отсортированных CD8 ⁺ Т-клеток были трансплантированы в BALB / c, вместе с _TCD BM, как описано выше.Через семь дней после трансплантации донорские клетки очищали от селезенки. Образцы были отправлены в центр секвенирования SUNY Upstate Medical University Sequencing для секвенирования РНК. Нам не удалось отсортировать достаточное количество донорских Т-клеток из тонкого кишечника мышей-реципиентов, которые получили Itk ^{— / —} Т-клеток. Таким образом, мы получили данные секвенирования РНК из пяти групп: WT-Pre и Itk ^{— / —} Pre клетки до трансплантации; WT-Spleen и Itk ^{— / —} Spleen с использованием клеток, выделенных через 7 дней после трансплантации.Число копий дополнительно анализировали в Gene Spring для нормализации, контроля качества, корреляции, анализа главных компонентов и дифференциальной экспрессии генов. Данные секвенирования хранятся на (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Вестерн-блоттинг

Клетки лизировали в свежеприготовленном буфере для лизиса с использованием буфера RIPA (Fisher Scientific) и коктейля полного ингибитора протеазы (Fisher Scientific) и центрифугировали в течение 10 минут при 4 ° C. Аликвоты, содержащие 70 мкг белка, разделяли на 12–18% денатурирующем полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозные мембраны для иммуноблот-анализа с использованием специфических Abs.

Анализ qPCR

Для подтверждения различий, наблюдаемых при секвенировании РНК, до- и посттрансплантированные донорские Т-клетки были отсортированы с помощью FACS от мышей-реципиентов по маркерам h3K ^b , а общая РНК была выделена из Т-клеток с использованием набора RNeasy из Qiagen (Джермантаун, Мэриленд). кДНК получали из общей РНК с использованием набора для синтеза кДНК (Invitrogen). Анализ qRT-PCR выполняли с предварительно изготовленным индивидуальным планшетом (Fisher Scientific, Hampton, NH).

Образцы пациентов

Мы также изолировали плазму от пациентов с РТПХ и здоровых доноров и выполнили цитокиновый ELISA на этих образцах плазмы, используя наборы для множественного ELISA (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния).Работа выполнена в соответствии с утвержденным протоколом IRB 1522145-2.

Статистика

Все числовые данные представлены как средние значения со стандартным отклонением. Данные были проанализированы на предмет значимости с помощью GraphPad Prism. Различия определяли с помощью одно- или двустороннего дисперсионного анализа и тестов множественных сравнений Тьюки или, при необходимости, с помощью t-критерия Стьюдента. Значения P меньше или равные 0,05 считаются значимыми. Все эксперименты по трансплантации проводились с N = 5 мышами на группу и повторялись не менее двух раз, согласно анализу мощности.Мыши одинаковы по полу и по возрасту, насколько это возможно.

Результаты

Удаление ITK сохраняет эффект GVL, но предотвращает GVHD во время Allo-HSCT

Чтобы определить, влияет ли TCR-опосредованная активация ITK на патогенез GVHD после алло-HSCT, мы исследовали эффекты передачи сигналов ITK на CD4 донора ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки в модели алло-трансплантации с использованием мышей C57Bl / 6 (гаплотип b MHC) в качестве доноров и мышей BALB / c (гаплотип d MHC) в качестве реципиентов. Чтобы вызвать GVHD, мы использовали доноров и реципиентов с несовпадающими MHC, _TCD BM из B6.PL- Thy1 ^a / CyJ (Thy1.1) мышей и Т-клетки от мышей C57BL / 6 (B6) WT или Itk ^{— / —} мышей. Смертельно облученным мышам BALB / c внутривенно вводили 10 × 10 ⁶ ВМ клеток дикого типа (WT) _TCD вместе с 2 × 10 ⁶ FACS-сортированных донорских Т-клеток (1 × 10 ⁶ CD8 ⁺ и 1 × 10 ⁶ CD4 ( ⁺ ) с последующей внутривенной провокацией 2 × 10 ⁵ бластных клеток B-ALL- , экспрессирующих люциферазу, luc , как описано (16).Мышей-реципиентов BALB / c наблюдали на предмет роста раковых клеток с использованием биолюминесцентной визуализации IVIS в течение более 60 дней >> (рис. 1A). В то время как рост лейкозных клеток наблюдался у мышей с трансплантированными BM с истощенными Т-клетками без Т-клеток, рост лейкозных клеток не наблюдался у мышей, трансплантированных Т-клетками от мышей WT или Itk ^{— / —} . Как и ожидалось, мыши, которым трансплантировали Т-клетки дикого типа, очищали лейкозные клетки, но страдали от GVHD. Напротив, мыши, которым трансплантировали Itk ^{— / —} Т-клетки, очищали лейкозные клетки и демонстрировали минимальные признаки GVHD.Большинство животных, которым трансплантировали Itk ^{— / —} Т-клеток, выживали в течение более 65 дней после алло-ТГСК (рис. 1В) со значительно большей выживаемостью и меньшими клиническими показателями по сравнению с животными, которым трансплантировали Т-клетки дикого типа [оценка основана на вес, поза, активность, текстура меха и целостность кожи, как описано ранее (19) (Рисунки 1C, D)]. Мыши BALB / c, которым трансплантировали Itk ^{— / —} Т-клетки, показали только остаточный рост опухолевых клеток (измеренный с помощью биолюминесценции), показывая, что донорские клетки сохраняли функции GVT, аналогичные WT T-клеткам (рис. 1E).Донорские Т-клетки CD8 ⁺ более эффективны, чем Т-клетки CD4 ⁺ в опосредовании эффектов GVL, но как CD4 ⁺ , так и CD8 ⁺ Т-клетки опосредуют тяжелую GVHD у мышей и людей (23-25). Чтобы определить, может ли внутренняя передача сигналов ITK CD4 ⁺ Т-клеткам быть достаточной для индукции РТПХ, мы повторили те же эксперименты, используя очищенные Т-клетки CD4 ⁺ либо от WT, либо от Itk ^{— / —} мышей в MHC- модель мыши с несоответствием алло-HSCT (B6 → BALB / c) (дополнительные рисунки 1A – C).Реципиенты Т-клеток CD4 ⁺ дикого типа демонстрировали худшую выживаемость по сравнению с мышами, получавшими только клетки ВМ _TCD (дополнительная фигура 1А). Напротив, у реципиентов _TCD BM, смешанных с Itk ^{— / —} CD4 ⁺ Т-лимфоциты, значительно снизили смертность и клинические показатели (дополнительный рисунок 1В), что указывает на то, что передача сигналов ITK CD4 ⁺ Т-клеткам значительно снижена. может способствовать тяжести РТПХ. Наши результаты показывают, что передача сигналов ITK необязательна для противолейкозного иммунитета, но необходима для РТПХ.

Рисунок 1 Отсутствие ITK позволяет избежать GVHD, сохраняя эффекты GVL во время алло-HSCT. 1 × 10 ⁶ очищенных CD4 + и 1 × 10 ⁶ CD8 + Т-клеток (WT или Itk ^{— / —} ) были смешаны в соотношении 1: 1 и трансплантированы вместе с 2 × 10 ⁵ B -ALL- luc у облученных мышей BALB / c. Мышей-хозяев BALB / c визуализировали с помощью системы визуализации IVIS 3 раза в неделю. Группа 1 получала 10 × 10 ⁶ только костного мозга с истощенными Т-клетками (обозначена как _TCD BM).Группа 2 получала 10 × 10 ⁶ _TCD BM вместе с 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc клеток ( _TCD BM + B-ALL ^luc +), Группа 3 была трансплантирована с 1 × 10 ⁶ очищенных WT CD8 ⁺ и 1 × 10 ⁶ CD4 ⁺ Т-клеток (соотношение 1: 1) вместе с 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc + клеток 10 × 10 ⁶ ( _TCD BM + B-ALL ^luc + WT CD8 + CD4). Группа 4 получала 1 × 10 ⁶ очищенных Itk ^{— / —} CD8 ⁺ и 1 × 10 ⁶ CD4 ⁺ Т-клеток (соотношение 1: 1) вместе с 2 × 10 ⁵ B -ALL- luc + клетки 10 × 10 ⁶ ( _TCD BM + B-ALL ^luc + Itk ^{— / —} CD8 + CD4). (A) Реципиентных мышей BALB / c визуализировали с помощью IVIS 3 раза в неделю. (B) Мышей наблюдали на выживаемость, (C) изменений массы тела и (D) клиническую оценку в течение 65 дней после BMT. (E) Количественная оценка люциферазной биолюминесценции роста лейкозных клеток. Статистический анализ выживаемости и клинической оценки был выполнен с использованием лог-рангового теста и двухфакторного дисперсионного анализа, соответственно. Для изменений веса и клинической оценки показан один представитель 2 независимых экспериментов (n = 3 мыши / группа только для BM; n = 5 экспериментальных мышей / группа для всех трех групп.Выживание — это комбинация двух экспериментов. Значения P представлены для каждой группы. Для статистического анализа использовались двусторонний дисперсионный анализ ANOVA и t-критерий Стьюдента. Примечание: Контроли представляют собой наивные мыши, используемые в качестве отрицательного контроля для биолюминесценции (BLI) .

Т-клетки Фенотип врожденной памяти недостаточен для эффектов РТПХ, а регуляторная функция ITK при РТПХ является присущей Т-клеткам

Фенотип врожденной памяти (IMP: CD44 ^hi CD122 ^hi и Eomes ^hi ) (26) из Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клетки возникают в тимусе во время развития, в отличие от Т-клеток памяти CD8 ⁺ , которые также являются CD44 ^hi , но в основном возникают на периферии Мыши WT в ответ на чужеродные антигены или из-за гомеостатической пролиферации (27).Мы исследовали предварительно трансплантированные CD8 ⁺ Т-клетки на экспрессию CD44 ^hi CD122 ^hi и Eomes ^hi и обнаружили, что Itk ^{— / —} Т-клетки экспрессировали более высокие уровни CD44 ^hi CD122 ^hi и Eomes ^hi по сравнению с CD8 ⁺ Т-клетками от мышей WT (рис. 2А). Мы стремились понять, достаточно ли появления IMP T-клеток для отделения GVHD от GVL. Чтобы проверить это, мы сгенерировали Т-клетки IMP дикого типа, используя подход смешанного костного мозга, при котором истощенный по Т-клеткам костный мозг мышей дикого типа и Itk ^{— / —} мышей смешивали в соотношении 3: 1 (WT: Itk ^{— / —} ) соотношение (26).Облученные конгенные (B6) хозяева Thy1.1 были восстановлены этой смесью _TCD BM CD45.2 ⁺ WT и CD45.1 ⁺ Itk ^{— / —} BM клеток вместе с контрольной группой получение смешанных клеток ВМ CD45.2 ⁺ WT и CD45.1 ⁺ WT (фигура 2B). Тимоциты CD8 ⁺ , происходящие из WT BM, которые развиваются в таких смешанных химерах BM, приобретают фенотип IMP из-за своего развития в том же тимусе, что и Itk ^{— / —} Т-клетки (26), что мы также наблюдали в нашем исследовании. эксперименты (рисунок 2B).Через десять недель после восстановления компартмента Т-клеток, Т-клетки, полученные из донорских клеток WT (CD45.2 ⁺ Thy1.1 ^— ) и Itk ^{— / —} (CD45.1 ⁺ ), были отсортированы из химер костного мозга. Эти отсортированные Т-клетки трансплантировали облученным мышам BALB / c вместе с _TCD BM в модели алло-HSCT, как описано выше, и тестировали на их функцию при GVHD и GVL. Анализ BALB / c-реципиентов этих различных IMP CD8 ⁺ T-клеток показывает, что IMP-клетки WT не были способны разделять GVL и GVHD (Рисунки 2C – G).Таким образом, появления IMP недостаточно, чтобы отделить GVHD от GVL.

Рисунок 2 Регуляторная функция ITK при GVHD является присущей Т-клеткам. (A) Очищенные WT и Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клетки исследовали на экспрессию CD44, CD122 и Eomes перед трансплантацией. (B) Целые клетки костного мозга, выделенные из мышей C57Bl / 6 WT (CD45.2) и Itk ^{— / —} (CD45.1), смешивали в 1: 3 рационе WT: Itk ^{— / —} , и трансплантировали в облученный Thy1.1 мышь C57Bl / 6. Через 9-10 недель Т-клетки CD8 ⁺ были отсортированы по экспрессии CD45.2 и CD45.1 (донорские Т-клетки) и исключению Thy1.1-положительных (Т-клетки-хозяева). Выделенные отсортированные Т-клетки исследовали на экспрессию CD44, CD122 и Eomes и трансплантировали облученным мышам BALB / c. Этот эксперимент повторяли более трех раз. (C) Облученных мышей BALB / c разделили на четыре разные группы и трансплантировали отсортированные Т-клетки, описанные в (B) , следующим образом: Группе 1 трансплантировали 10 × 10 ⁶ _{только TCD} BM ( _TCD BM).Группе 2 трансплантировали 10 × 10 ⁶ _TCD BM и 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc , ( _TCD BM + B-ALL ^luc ). Группе 3 трансплантировали 10 × 10 ⁶ _TCD BM вместе с 1 × 10 ⁶ очищенных WT CD8 ⁺ Т-клеток и 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc ( _TCD BM + B-ALL ^luc + WT CD45.2). Четвертой группе пересаживали 10 × 10 ⁶ _TCD BM вместе с и 1 × 10 ⁶ очищенных Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клеток и 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc ( _TCD BM + B-ALL ^luc + Itk ^{— / —} CD45.1). За этими мышами наблюдали рост лейкозных клеток с помощью системы IVIS. (D) Мышей наблюдали на выживаемость, (E), изменений массы тела и (F) клинических баллов в течение 47 дней после BMT. Для изменений массы тела и клинической оценки показан один представитель 2 независимых экспериментов (n = 3 мыши / группа только для BM; n = 5 экспериментальных мышей / группа для всех трех групп). (G) Количественная оценка люциферазной биолюминесценции люциферазы, экспрессирующей клетки B-ALL- luc .Статистический анализ выживаемости и клинической оценки был выполнен с использованием лог-рангового теста и двухфакторного дисперсионного анализа, соответственно. Один репрезентативный эксперимент из 2. Выживание представляет собой комбинацию 2 экспериментов, 3 мышей на группу контроля _TCD BM и 5 мышей на группу для всех экспериментальных групп. Значение P представлено с каждой цифрой. Примечание: Контроли представляют собой наивные мыши, используемые в качестве отрицательного контроля для BLI .

Как обсуждалось ранее, Itk ^{— / —} CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клетки демонстрируют ослабленную передачу сигналов TCR и IMP (26), на что указывает экспрессия высоких уровней CD44, CD122 и Eomes. , в частности, Т-лимфоцитами CD8 ⁺ (Фигуры 3A, B).Чтобы проверить, дают ли эти Т-клетки IMP от мышей Itk ^{— / —} ответы GVL, мы использовали мышиную модель алло-HSCT с несоответствием MHC (WT, Itk ^{— / —} → BALB / c, т.е. , h3K ^{b +} → h3K ^{d +} ). Затем мы отсортировали донорские Т-клетки h3K ^{b +} от мышей-реципиентов и определили их цитотоксичность в отношении клеток B-ALL- luc . Мы обнаружили, что эти донорские клетки эффективно убивали первичные лейкозные клетки in vitro , даже в отсутствие ITK (рис. 3C).Более того, мы наблюдали значительно повышенную экспрессию перфорина в Т-клетках CD8 ⁺ от мышей Itk ^{— / —} по сравнению с Т-клетками от мышей WT в отсутствие активации (фигура 3D). Наши результаты показывают, что CD8 ⁺ Т-клетки от мышей Itk ^{— / —} обладают повышенной активацией и проявляют цитотоксичность в отношении первичных лейкозных клеток.

Рисунок 3 Т-лимфоцитов IMP недостаточно для эффекта GVL. (A, B) Очищенные WT и Itk ^{— / —} CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клетки исследовали на экспрессию CD44, CD122 и Eomes с помощью проточной цитометрии. (C) Очищенные WT или Itk ^{— / —} Т-клетки трансплантировали облученным мышам BALB / c, на 7 день очищенные Т-клетки сортировали с использованием экспрессии h3K ^d , CD45.1 и CD45.2. Ex vivo очищенных CD8 ⁺ Т-клеток использовали в анализе цитотоксичности против первичных клеток-мишеней лейкемии B-ALL luc + в соотношении 40: 1, 20: 1 или 5: 1. (D) Очищенные Т-клетки исследовали на перфорин с помощью вестерн-блоттинга. Количественный анализ экспрессии перфорина с помощью вестерн-блоттинга с данными, нормализованными относительно β-актина. (E) Очищенные WT или Itk / Eomes Донорские Т-клетки DKO трансплантировали облученным мышам BALB / c. На 7 день донорские Т-клетки очищали, как описано, и использовали в анализе цитотоксичности ex vivo против B-ALL ^luc -клеток в соотношении 5: 1, 20: 1 и 40: 1. (F) 1 × 10 ⁶ очищенных WT и Itk ^{— / —} Itk / Eomes DKO CD8 ⁺ Т-клеток и 1 × 10 ⁶ очищенных CD4 ⁺ Всего 2 × 10 ⁶ смешанных CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток были смешаны и трансплантированы вместе с 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc клетками и 10 × 10 ⁶ _TCD BM в облученный BALB / c мышей.Мышей-хозяев BALB / c визуализировали с помощью IVIS 3 раза в неделю. Первая группа получала 10 × 10 ⁶ _TCD BM отдельно как ( _TCD BM). Вторая группа получала 10 × 10 ⁶ _TCD BM вместе с 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc клеток ( _TCD BM + B-ALL ^luc ). Группе 3 трансплантировали 10 × 10 ⁶ _TCD BM и 1 × 10 ⁶ очищенных WT CD8 ⁺ Т-клеток +1 × 10 ⁶ CD4 ⁺ Т-клеток и 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc клеток ( _TCD BM + B-ALL ^luc + WT CD8 + CD4).Четвертая группа получала 10 × 10 ⁶ T _TCD BM и 1 × 10 ⁶ очищенных CD8 ⁺ T-клеток +1 × 10 ⁶ CD4 ⁺ T-клеток от Itk / Eomes DKO вместе с 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc клеток ( _TCD BM + B ALL ^luc + Itk ^{— / —} EomesFF + CD4cre CD8 + CD4). Пятая группа получала 10 × 10 ⁶ _TCD BM и 1 × 10 ⁶ CD8 ⁺ Т-клеток +1 × 10 ⁶ CD4 ⁺ очищенных Т-клеток Itk / Eomes DKO CD4 ⁺ Т-клетки вместе с 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc клеток ( _TCD BM + B-ALL ^luc + Itk ^{— / — EomesFF + CD4cre-} CD8 + CD4 ). (F) Мышей наблюдали на выживаемость, изменения массы тела (G) и клиническую оценку (H) в течение 60 дней после ТКМ. Для изменений веса и клинической оценки показан один представитель из 2 независимых экспериментов (n = 3 мыши / группа только для BM; n = 5 экспериментальных мышей / группа для всех трех групп. Группы выживания представляют собой комбинацию всех экспериментов. ( I) Количественная биолюминесценция люциферазы роста опухоли.Статистический анализ выживаемости и клинической оценки был проведен с использованием логарифмически-двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA для статистического анализа, подтверждающего тест t студентов, представлены значения p. Примечание: Контроли представляют собой наивные мыши, используемые в качестве отрицательного контроля для биолюминесценции (BLI) .

IL-4, как известно, активирует Eomes в CD8 ⁺ Т-клетках (26, 28), что мы подтвердили путем сравнения Т-клеток мышей WT и Itk / Il4ra double KO (DKO). Удаление передачи сигналов IL-4 у мышей Itk ^{— / —} привело к снижению экспрессии Eomes в Itk ^{— / —} Т-клетках по сравнению с Т-клетками из Itk ^{— / —} и WT pre- пересажены (дополнительный рисунок 2A).Затем мы использовали краткосрочную модель алло-HSCT, где Т-клетки от WT или Itk / Il4ra DKO были трансплантированы облученным мышам BALB / c. Через 7 дней после трансплантации донорские Т-клетки WT или Itk / Il4ra DKO затем отсортировывали от мышей-реципиентов BALB / c и определяли экспрессию Eomes на этих донорских Т-клетках. Мы не наблюдали каких-либо различий между донорскими WT или Itk / Il4ra Т-клетками после активации алло (дополнительные рисунки 2A – C). Затем мы проверили функцию Itk / Il4ra DKO Т-клеток в долгосрочной модели алло-HSCT и наблюдали, что донорские Т-клетки от мышей Itk / Il4ra DKO не индуцировали РТПХ, и большинство животных выжило по сравнению получателям Т-клеток дикого типа (дополнительный рисунок 2D).BALB / c, трансплантированный с донорскими Т-клетками Itk / Il4ra и , также показал гораздо меньшую потерю веса и значительно лучшие клинические показатели по сравнению с мышами BALB / c, которым трансплантировали донорские Т-клетки WT (дополнительные рисунки 2D – G). Кроме того, донорские Т-клетки Itk / Il4ra DKO очищали лейкозные клетки, не вызывая РТПХ. Эти данные показывают, что фенотип IMP T-клеток может не быть критическим для GVHD, но модуляция ITK действительно влияет на GVHD, не влияя на GVL.

Чтобы исследовать роль Eomes в очищении лейкозных клеток и в цитотоксической функции, мы скрестили Itk ^{— / —} мышей с Eomes ^{flox / flox} мышей и скрестили это потомство с мышами CD4cre для удаления Eomes. конкретно в Т-клетках (28, 29) для генерации ( Itk / Eomes DKO).Мы провели аналогичные эксперименты с алло-HSCT, как описано выше, и использовали Т-клетки WT или Itk / Eomes DKO. Через семь дней после трансплантации донорские Т-клетки были отсортированы с использованием экспрессии h3K ^b , и анализы цитотоксичности in vitro были выполнены при соотношении 5: 1, 20: 1 и 40: 1 (эффектор: мишень). Наши данные показывают, что ex vivo донор Itk / Eomes DKO не смогли убить раковые мишени (рис. 3E). Чтобы изучить роль Eomes в модели алло-HSCT, мышей BALB / c смертельно облучали и внутривенно вводили 10 × 10 ⁶ WT _TCD ВМ-клеток вместе с отсортированными по FACS CD8 ⁺ и CD4 ⁺ . Т-клетки от мышей-доноров (WT, Itk ^{— / —} Eomes DKO).После этого проводили внутривенное заражение 2 × 10 ⁵ бластными клетками B-ALL- , экспрессирующими люциферазу, luc , как описано (17). Животные-реципиенты, которым трансплантировали Т-клетки дикого типа, очищали опухолевые клетки, но имели снижение выживаемости и РТПХ (рисунки 3F – I). Животные-реципиенты, которым трансплантировали Itk ^{— / —} Eomes DKO Т-клетки, однако, не очищали лейкозные клетки, не проявляя признаков GVHD (фиг. 3I). Примечательно, что животные-реципиенты, которым трансплантировали Itk / Eomes DKO T-клеток, не смогли очистить опухоль, и все они умерли от бремени рака.Эти данные предоставили дополнительные доказательства того, что Eomes необходим для эффекта GVL.

Дефицит ITK приводит к снижению продукции цитокинов

Известно, что режим кондиционирования алло-ТГСК вызывает увеличение продукции воспалительных цитокинов донорскими Т-клетками, и это считается одним из отличительных признаков патогенеза РТПХ ( 30). Мы взяли образцы крови у пациентов с GVHD и здоровых доноров и исследовали уровни воспалительных цитокинов в сыворотке крови, таких как IL-33, IL-1α, IFNγ, TNFα и IL-17A.Мы наблюдали, что пациенты с GVHD имеют значительно более высокие уровни провоспалительных цитокинов в сыворотке по сравнению со здоровым контролем (рис. 4A). Затем мы оценили продукцию цитокинов Itk ^{— / —} CD8 и CD4 T-клетками в нашей модели алло-HSCT (B6 → BALB / c), исследуя уровни воспалительных цитокинов в сыворотке крови, таких как IL-33, IL-1α. , IFN-γ, TNF-α и IL-17A на 7 день после аллотрансплантации (Фигуры 4B, C). Мы обнаружили, что сывороточные IFN-γ и TNF-α были значительно снижены у реципиентов, которые получали Itk ^{— / —} CD8 ⁺ T или CD4 ⁺ T-клеток по сравнению с теми, кто получал WT CD8 ⁺ или CD4. ⁺ Т-клеток (Фигура 4B, C).Таким образом, мы подтвердили, что результаты нашей доклинической модели коррелируют с тем, что мы обнаружили в образцах человеческого РТПХ. Мы также выделили Itk ^{— / —} донорских Т-клеток из вторичных лимфоидных органов реципиентов, используя антитела против h3K ^b (экспрессируемые донорскими клетками C57Bl / 6). Через 7 дней после аллотрансплантации клетки стимулировали анти-CD3 / CD28 (фиг.4D) или PMA / иономицином [для обхода проксимального дефекта передачи сигнала TCR (31) (дополнительная фигура 3)] в присутствии брефельдина A, или оставались нестимулированными в течение 6 часов с последующим анализом продукции цитокинов IFN-γ и TNF-α. Itk ^{— / —} Т-клетки были способны продуцировать IFN-γ и TNF-α на уровнях, сравнимых с WT-клетками, когда передача сигналов CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клеток обходилась путем повторной стимуляции PMA и иономицин (дополнительная фигура 3). Однако клетки Itk ^{— / —} продуцировали значительно меньше воспалительных цитокинов при стимуляции через TCR / CD28, чем клетки WT (Фигуры 4D, E). Затем мы определили, вызвано ли снижение продукции цитокинов Itk ^{— / —} донорскими Т-клетками внутренними или внешними факторами.Мы смешали очищенные Itk ^{— / —} CD8 ⁺ T и CD4 T-клетки с очищенными WT CD8 ⁺ или CD4 ⁺ T-клетками отдельно в соотношении 1: 1 и трансплантировали смешанные клетки в облученный BALB. / c мышей, как описано выше. На 7 день донорские Т-клетки выделяли от мышей-реципиентов с использованием h3K ^{b +} и исследовали на экспрессию IFN-γ и TNF-α, как описано выше. Мы обнаружили, что WT донорские Т-клетки CD8 ⁺ и CD4 ⁺ продуцировали более высокие уровни воспалительных цитокинов, чем Itk ^{— / —} донорские CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клетки, соответственно, что позволяет предположить, что снижение продукция цитокинов, наблюдаемая Itk ^{— / —} донорских Т-клеток, присуща Т-клеткам (фиг. 4F).

Рис. 4 Дефицит ITK приводит к снижению продукции цитокинов. (A) Сыворотка нескольких пациентов с GVHD была выделена и исследована на продукцию воспалительных цитокинов (IL-33, IL1α, IFN-γ и TNF-α, IL1β и IL-17A), как определено с помощью ELISA. (B , C) 1 × 10 ⁶ очищенных WT или Itk ^{— / —} CD8 ⁺ T или CD4 ⁺ T-клеток отдельно трансплантировали облученным мышам BALB / c. На 7 день после алло-ТГСК реципиента BALB / c подвергали эвтаназии и измеряли сывороточные цитокины (IL-33, IL1α, IFN-γ, TNF-α и IL-17A) с помощью ELISA. (D) Внутриклеточная экспрессия IFN-γ и TNF-α донорскими CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клетками после стимуляции анти-CD3 / анти-CD28, как определено с помощью проточной цитометрии. (E , F) Объединенные данные 3 независимых экспериментов показаны для каждого эксперимента, показанного на рисунках. (F) Анализ проточной цитометрии очищенных WT и Itk ^{— / —} Т-клеток, которые были смешаны в соотношении 1: 1 для трансплантации облученным мышам BALB / c.На 7 день донорские Т-клетки были заблокированы для экспрессии H-2K ^b , CD45.1 и CD45.2, и внутриклеточная экспрессия IFN-γ и TNF-α была проанализирована с помощью проточной цитометрии после стимуляции анти-CD3 / антибиотиком. -CD28. Показаны объединенные данные из четырех независимых экспериментов, и показано значение p для каждого эксперимента. (G) Очищенные WT или Itk ^{— / —} донорские CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клетки трансплантировали в облученный BALB / c. На 7 день донорские клетки анализировали на пролиферацию донорских Т-клеток, исследуя включение BrdU с помощью проточной цитометрии. (H) Очищенные WT и Itk ^{— / —} донорских Т-клеток смешивали в соотношении 1: 1 WT: Itk ^{— / —} и трансплантировали облученным мышам BALB / c на 7 день в селезенку. донорские Т-клетки регистрировали на предмет экспрессии H-2K ^b , CD45.1 и CD45.2 и анализировали на включение BrDU. (I) Очищенные WT и Itk ^{— / —} Т-клетки стимулировали CD3 и CD28 в течение ночи и исследовали на экспрессию и фосфорилирование IRF4, JAK1 / 2 и STAT3 с помощью вестерн-блоттинга.Для статистического анализа использовали двухфакторный дисперсионный анализ и тест Стьюдента t , представлены значения p.

Затем мы исследовали пролиферацию Т-клеток CD4 ⁺ и CD8 ⁺ доноров, используя анализ включения BrdU. Через 7 дней после аллотрансплантации, как описано выше, трансплантированные CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки селезенки исследовали на пролиферацию путем включения BrdU. Itk ^{— / —} донор CD8 ⁺ показал статистически значимое снижение пролиферации по сравнению с WT донорскими CD8 ⁺ Т-клетками, хотя не было никакой разницы в пролиферации между WT и Itk ^{— / —} CD4 ⁺ Т-клеток (Рисунок 4G).Чтобы определить, является ли снижение пролиферации Itk ^{— / —} донорскими Т-клетками внутренними механизмами, мы смешали очищенные очищенные смешанные Itk ^{— / —} и WT CD4 ⁺ или Itk ^{— / —} и WT CD8 ⁺ в соотношении 1: 1 с последующей трансплантацией, как описано выше. Интересно, что не наблюдалось различий во включении BrdU в донорские Т-клетки из селезенки мышей-реципиентов между WT и Itk ^{— / —} донорскими CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетками в моделях смешанной трансплантации, что указывает на снижение пролиферации донора Itk ^{— / —} Т-клетки пролиферация происходила из-за клеточно-внешних эффектов (рис. 4H).Таким образом, как внутренние, так и внешние механизмы клетки регулируют поведение Itk ^{— / —} CD8 ⁺ и CD4 ⁺ донорских Т-клеток.

Фактор транскрипции IRF4, как было показано, играет критическую роль в поддержании передачи сигналов TCR, включая силу сигнала TCR, например, регулируемых ITK (32). Сигнальный путь JAK / STAT также важен для ответа Т-клеток на цитокины (33, 34). Чтобы проверить, существует ли разница в этих сигнальных путях между WT и Itk ^{— / —} донорскими Т-клетками в модели GVHD и GVL, мы исследовали экспрессию IRF4, JAK1, JAK2 и STAT3 очищенными Т-клетками селезенки, которые имели стимулировали в течение ночи CD3 и CD28 с последующим лизисом для анализа белка.Наши данные показали, что Itk ^{— / —} донорские Т-клетки экспрессировали значительно меньше IRF4, JAK1, JAK2 и STAT3, а также фосфорилированных форм JAK1, JAK2 и STAT3 (Рисунок 4I и дополнительные рисунки 4A – D). Наши данные предполагают, что отсутствие ITK влияет на экспрессию IRF4 и, таким образом, на количество цитокиновых сигналов, которые получают клетки. Эти данные могут объяснить наблюдаемое выше снижение продукции и пролиферации цитокинов в Itk ^{— / —} Т-клетках.

ITK по-разному регулирует экспрессию генов в Т-клетках во время РТПХ

В качестве объективного подхода к дальнейшему изучению различий между WT и Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клетками мы использовали анализ секвенирования РНК для изучения различий в экспрессия гена между WT и Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клетки после алло-HSCT.Мы сортируем очищенных доноров WT и Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клеток (с использованием антигена H-2K ^b , экспрессируемого донорскими Т-клетками) до и через 7 дней после их переноса облученным реципиентам BALB / c. , и последовательности РНК. Хотя WT и Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клетки различаются до трансплантации из-за усиленного IMP в отсутствие ITK, WT и Itk ^{— / —} Т-клеток, которые находятся в селезенке посттрансплантационные сходны, о чем свидетельствует тот факт, что они сгруппированы в непосредственной близости в анализах основных компонентов (PCA) (рис. 5A).Нам не удалось собрать достаточное количество клеток из кишечника Itk ^{— / —} реципиентов Т-лимфоцитов, так как они испытывают дефицит самонаведения в кишечнике (см. Рисунки 6B – D). Для дальнейшего определения дифференциально экспрессируемых генов, которые уникальны для Т-клеток WT CD8 ⁺ и связаны с их способностью жить в органах-мишенях GVHD, мы сравнили списки генов, которые были активированы или подавлены после переноса клеток. в получателей и размещены в разных органах.Гены, которые по-разному экспрессируются в Т-клетках дикого типа, которые были способны жить в органе-мишени GVHD, могут обнаруживать сигналы, дефицитные из-за отсутствия ITK. Поэтому мы извлекли список генов, которые активируются или подавляются только в Т-клетках дикого типа, выделенных из кишечника реципиента после трансплантации (на рисунках 5B, C показаны 20 генов с повышенной и 27 отрицательной регуляцией). Дифференциально экспрессируемые гены между WT и Itk ^{— / —} донорские Т-клетки были обогащены транскриптами, кодирующими молекулы самонаведения лимфоцитов, такие как молекулы адгезии и сигнальные белки хемокинов, которые могут вносить вклад в дефектную способность самонаведения Itk ^{— / —} донорских Т-клеток (Фигура 5E).Результаты критических генов, которые дифференциально экспрессировались, были подтверждены с помощью q-RT-PCR (рис. 5D). Используя анализ обогащения пути, наши данные также выявили критическую роль ITK в регулировании генов, участвующих во взаимодействии Т-клеточных цитокинов / цитокиновых рецепторов, клеточной адгезии, реакции трансплантат против хозяина, отторжении аллотрансплантата и путях передачи сигналов хемокинов (рис. 5E). Эти данные предполагают, что ITK регулирует экспрессию сигнатурных генов, связанных с хомингом трансплантированных клеток в органы-мишени GVHD, в то время как он не оказывает очевидного эффекта на хоминг Т-клеток в селезенке.Это может частично объяснять способность Itk ^{— / —} Т-клеток поддерживать эффекты GVL, будучи неспособными вернуться в органы-мишени GVHD и участвовать в GVHD.

Рисунок 5 ITK дифференциально регулирует экспрессию генов в Т-клетках во время GVHD. WT и Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клетки были отсортированы с помощью FACS, затем трансплантированы облученным мышам BALB / c. На 7 день после трансплантации донорские Т-клетки отделяли (на основе экспрессии H-2K ^b , CD3 и CD8) из селезенки хозяина.Отсортированные донорские Т-клетки подвергали РНК-секвенированию. (A) Анализ главных компонентов генов с ≥2-кратным изменением в любых парах групповых комбинаций, с коэффициентом ложного обнаружения (FDR) ≤ 0,05. WT-Pre и Itk ^{— / —} Pre обозначает клетки до переноса, а WT-Spl и Itk ^{— / —} Spl обозначает клетки, выделенные из селезенки (Spl) реципиентов после переноса. (B) Диаграмма Венна генов, которые ≥2-кратно повышают или понижают регуляцию в указанных сравнениях, с FDR ( P ) ≤ 0.05. (C) Тепловая карта дифференциально экспрессируемых генов, перечисленных как (1) WT pre. (2) ITK — / — до, (3) WT после селезенки и (4) ITK — / — после селезенки. (E) Дифференциально экспрессируемые гены были обогащены для анализа путей сравнения WT и Itk ^{— / —} . (D) WT и Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клетки были отсортированы с помощью FACS, затем трансплантированы облученным мышам BALB / c. На 7 день после трансплантации донорские Т-клетки отделяли (на основе экспрессии H-2K ^b , CD3 и CD8) из селезенки и тонкой кишки хозяина (кишечник).Тотальную РНК выделяли из отсортированных донорских Т-клеток и проводили количественную ПЦР.

Рис. 6. Передача сигналов ITK необходима для миграции Т-клеток в ткани-мишени GVHD. (A) Облученным мышам BALB / c трансплантировали алло-HSCT и инъецировали WT, отсортированные по FACS, и Itk ^{— / —} CD8 ⁺ T и CD4 ⁺ T-клетки, смешанные в соотношении 1: 1 соотношение. Показан FACS-анализ отсортированных Т-клеток перед трансплантацией. (B) На 7-й день после BMT селезенку, печень и тонкий кишечник (SI) исследовали на наличие донорских WT и Itk ^{— / —} Т-клеток.Определяли соотношение WT: Itk ^{— / —} CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клеток в органах. (C) На 7 день после алло-ТГСК тонкий кишечник исследовали путем окрашивания H&E. (D) Облученным мышам BALB / c трансплантировали BM и инъецировали CD8 ⁺ T CD4 ⁺ Т-клетки от мышей WT, экспрессирующих люциферазу, или мышей Itk ^{— / —} . (E) На 7 день после алло-HSCT, донорские Т-клетки выделяли и исследовали на экспрессию Aplnr, Cxcr5, Accr2, CCL12, CCL2, CCL5, CCr9, Ackr4 и Cmtm4 с использованием q-RTPCR.Значения P были рассчитаны с использованием двухфакторного дисперсионного анализа и критерия Стьюдента t , значения p перечислены. (F) Облученным мышам BALB / c трансплантировали BM, полученный из C57Bl / 6, и отсортированные по FACS WT или Itk ^{— / —} 1 × 10 ⁶ CD8 ⁺ Т-клетки и подкожно заражали 2 × 10 ⁵ экспрессирующих люциферазу клеток B-All luc . За животными-реципиентами наблюдали изменения веса. Первой группе мышей-реципиентов трансплантировали 10 × 10 ⁶ _TCD BM.Второй группе мышей-реципиентов трансплантировали 10 × 10 ⁶ _TCD BM и 2 × 10 ⁵ первичных B-ALL luc + клеток ( _TCD BM + B-ALL ^luc ). Третьей группе мышей-реципиентов трансплантировали 10 × 10 ⁶ _TCD BM вместе с 1 × 10 ⁶ Т-клеток от мышей WT вместе с 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc + клеток ( _TCD BM + B-ALL ^luc + WT CD8). Четвертой группе мышей-реципиентов трансплантировали 10 × 10 ⁶ _TCD BM и 1 × 10 ⁶ Т-клеток от Itk ^{— / —} мышей вместе с 2 × 10 ⁵ B-ALL- люк + ячеек.( _TCD BM + B-ALL ^luc + Itk ^{— / —} CD8). Показаны типичные изображения биолюминесценции мышей, несущих лейкозные клетки, на 9, 16, 30, 38 и 47 дни. Примечание: Контроли представляют собой наивные мыши, используемые в качестве отрицательного контроля для биолюминесценции (BLI). (G) Животных наблюдали на выживаемость в течение 47 дней, (H) на изменения в потере веса, (I) и на клиническую оценку. (J) Мышей-реципиентов наблюдали за ростом лейкозных клеток с использованием системы визуализации IVIS, и показаны количественные данные.Для изменений веса и роста лейкозных клеток показан один представитель 2 независимых экспериментов (n = 3 мыши / группа для контроля, n = 5 мышей для WT и n = 5 мышей для Itk ^{— / —} ). групп выживания были объединены из обоих экспериментов. Значения P были рассчитаны с использованием двустороннего дисперсионного анализа и теста Стьюдента t , значения p перечислены.

Передача сигналов ITK необходима для миграции Т-клеток в ткани-мишени РТПХ

РТПХ включает раннюю миграцию аллореактивных Т-клеток в органы-мишени с последующим размножением Т-клеток и разрушением тканей.Было высказано предположение, что модуляция аллореактивного транспорта Т-клеток играет важную роль в улучшении экспериментальной РТПХ (35). Поэтому мы исследовали перенос донорских Т-клеток в ткани-мишени GVHD, как описано ранее (35). Облученным мышам-реципиентам BALB / c вводили CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клетки от Itk ^{— / —} (CD45.2 ⁺ ) и мышей WT B6LY5 (CD45.1 ⁺ ), смешанных при соотношении 1: 1 (рис. 6А) и через 7 дней после трансплантации мышей-реципиентов исследовали на наличие донорских CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клеток в селезенке, лимфатических узлах, печени и тонком кишечнике. .В то время как соотношение Т-клеток WT: Itk ^{— / —} CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клеток оставалось примерно 1: 1 в селезенке и лимфатических узлах (рис. 6В), это соотношение в печени и тонком кишечнике было значительным. повышены, что свидетельствует о том, что Itk ^{— / —} CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клетки были дефектными по миграции и / или размножению в этих тканях. Используя гистологическое окрашивание на H&E, мы также наблюдали значительную инфильтрацию лейкоцитов в органы-мишени GVHD — печень, кожу и тонкий кишечник (SI) (36) у реципиентов Т-клеток дикого типа, но не у реципиентов Т-клеток Itk ^{— / —} Т-клеток ( Рисунок 6C).В качестве альтернативного подхода мы отслеживали как CD8 ⁺ , так и CD4 ⁺ Т-клетки у мышей алло-BMT с использованием донорских CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клеток от WT и Itk ^{— / —} мышей. которые также экспрессируют люциферазу, что можно отслеживать с помощью биолюминесценции (37). Мы наблюдали, что как CD8 ⁺ , так и CD4 ⁺ донорские Т-клетки от Itk ^{— / —} мышей имели значительно нарушенную резидентность в органах-мишенях GVHD, включая печень и тонкий кишечник, по сравнению с WT, несмотря на нет различий в селезенке и лимфатических узлах (рис. 6D).Вторичные лимфатические узлы (селезенка и лимфатические узлы) и мишени GVHD, тонкая кишка (SI) и печень были количественно определены биолюминесценцией люциферазы (дополнительные рисунки 5A, B). В модели смешанного переноса Т-клеток мы определили, что Itk ^{— / —} Т-клеточная пролиферация сопоставима с пролиферацией клеток WT; следовательно, очень вероятно, что снижение количества Itk ^{— / —} Т-клеток в печени и тонком кишечнике было связано с нарушением транспорта Т-клеток. Провоспалительное кондиционирующее лечение может способствовать миграции Т-клеток в ткани-мишени GVHD (38, 39).Действительно, в той же смешанной модели переноса Т-клеток мы обнаружили, что экспрессия хемокинов и хемокиновых рецепторов (Aplnr, Cxcr5, Accr2, CCL12, CCL2, CCL5, Ccr9, Ackr4 и Cmtm4) также значительно снижена в Itk ^{— / —} CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клетки на 7 день после трансплантации (фигура 6E). Эти данные предполагают, что Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клетки демонстрируют ослабленную экспрессию хемокиновых рецепторов, что коррелирует с дефектной миграцией в органы-мишени GVHD и уменьшением патологии органа-мишени.

Учитывая, что Itk ^{— / —} Т-клетки демонстрируют дефектную миграцию к органам-мишеням РТПХ, мы предсказали, что хотя Itk ^{— / —} Т-клетки могут очищать лейкозные клетки крови и вторичных лимфоидных органов, они не сможет убить лейкозные клетки, находящиеся в тканях. Чтобы проверить эту возможность, смертельно облученным мышам BALB / c трансплантировали BM вместе с FACS-сортированными WT или Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клетками и заражали подкожно введенными клетками B-All luc .Хотя Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клетки не вызывали РТПХ, лейкозные клетки, введенные подкожно, исчезли только у мышей, которым трансплантировали Т-клетки WT CD8 ⁺ , а не у тех, которым вводили Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клеток (Рисунок 6F – J). Вместе эти данные предполагают, что передача сигналов ITK в Т-клетках может отделять GVHD от эффектов GVL, но только для лейкозных клеток, которые находятся в кровотоке и во вторичных лимфоидных органах (таких как гематологические злокачественные новообразования).

Обсуждение

В этом отчете мы демонстрируем, что отсутствие регулируемой TCR киназы ITK значительно подавляет GVHD, сохраняя при этом эффект GVL в моделях алло-HSCT. Потеря ITK также изменяет экспрессию IRF4 и компонентов пути JAK / STAT JAK1, JAK2 и STAT, которые играют критическую роль в контроле экспрессии цитокинов (14, 39). Анализ транскриптома путем секвенирования РНК показал, что передача сигналов ITK контролирует экспрессию хемокиновых рецепторов во время этого процесса, что, в свою очередь, влияет на способность донорских Т-клеток мигрировать в органы-мишени GVHD.Взятые вместе, эти данные предполагают, что ITK может представлять собой потенциальную мишень для разделения ответов GVHD и GVL после алло-HSCT.

Способность Itk ^{— / —} Т-клеток индуцировать GVL, не вызывая GVHD, указывает на то, что сигнальный путь ITK участвует в патогенезе GVHD. Itk ^{— / —} Т-клетки развиваются в клетки IMP (фенотип CD122 ⁺ CD44 ^hi ) в тимусе, и возможно, что такие клетки ответственны за наблюдаемые нами эффекты GVHD и GVL.В экспериментах, в которых Т-клетки WT превратились в IMP, мы обнаружили, что они сохраняют способность индуцировать как острую GVHD, так и GVL, что предполагает присущую Т-клеткам функцию ITK в стимулировании GVHD во время алло-HSCT. Точно так же цитотоксичность Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клеток не зависит от IMP. В то время как IMP-клетки экспрессируют значительно более высокие Eomes по сравнению с их аналогами WT без IMP, мы обнаружили, что IMP CD8 ⁺ T-клетки не отвечают за различение GVHD и GVL.К нашему удивлению, мы отметили, что Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клетки проявляют аналогичную или более высокую цитотоксичность in vitro по сравнению с Т-клетками WT CD8 ⁺ . Это может быть связано с более высокими уровнями перфорина, экспрессируемого Itk ^{— / —} Т-клетками по сравнению с Т-клетками дикого типа.

Наши данные также показывают, что Itk ^{— / —} донорские CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки демонстрируют пониженную экспрессию хемокиновых рецепторов по сравнению с аналогами WT.Более того, миграция Itk ^{— / —} донорских Т-клеток к органам-мишеням также была серьезно дефектной, отражая сниженную экспрессию ключевых хемокиновых рецепторов. Дефектная миграция Itk ^{— / —} CD8 ⁺ и CD4 ⁺ T-клеток, вероятно, способствует ослаблению GVHD, поскольку эти T-клетки продолжают проявлять GVL-эффекты против лейкозных клеток, которые были введены внутривенно и находятся в вторичные лимфоидные органы. Напротив, WT, но не Itk ^{— / —} CD8 ⁺ Т-клетки были способны ингибировать рост лейкозных клеток, когда лейкозные клетки вводили подкожно.Компартментализация Т-клеток во вторичные лимфоидные органы может быть эффективной стратегией предотвращения GVHD, при этом не затрагивая эффекты GVL в отношении гематологических злокачественных новообразований. Примечательно, что ибрутиниб, ингибитор BTK, который также может ингибировать ITK, способен снижать хроническую GVHD (12). Кроме того, ранее опубликованные работы показали, что передача сигналов IFN-γR представляет собой основной механизм миграции донорских Т-клеток в органы-мишени GVHD (40, 41), и мы наблюдали, что отсутствие ITK влияет на продукцию IFN-γ.Удержание Т-клеток во вторичных лимфоидных органах посредством FTY720-опосредованного ингибирования S1P1 также улучшает GVHD, сохраняя эффекты GVL (42, 43). Точно так же ингибирование миграции Т-клеток в органы-мишени GVHD путем воздействия на хемокиновые рецепторы CCR2 или CCR5 защищает от патологии, вызванной GVHD (44, 45), которая, по крайней мере, при дефиците CCR2, как было показано, сохраняет эффект GVL. Важно отметить, что в клиническом исследовании блокада CCR5 низкомолекулярным антагонистом привела к снижению РТПХ без существенной разницы в частоте рецидивов, что свидетельствует о том, что блокирование миграции Т-клеток в ткани-мишени может снизить тяжесть РТПХ без ущерба для положительного эффекта GVL (45). .Кроме того, ингибирование CXCR3 улучшает GVHD у мышей с алло-HSCT (46). Активированные аллореактивные Т-клетки CD8 ⁺ повышают экспрессию CX3CR1 и CXCR6 после алло-HSCT (47, 48), и эти рецепторы важны для перемещения Т-клеток CD8 ⁺ в печень и кишечник. Таким образом, дефицит CXCR6 или блокада лигандов CXCR3 и CXCR6 ослабляет GVHD (47). Важно отметить, что в этих условиях эффект ГВЛ сохраняется (49). Таким образом, блокирование миграции Т-клеток с помощью блокады хемокиновых рецепторов может быть полезным при лечении РТПХ после алло-ТГСК.Поскольку активированные Itk ^{— / —} Т-клетки демонстрируют значительно сниженную экспрессию хемокиновых рецепторов, компартментализация CD8 ⁺ Т-клеток во вторичные лимфоидные органы, вероятно, способствует сохранению эффектов GVL при сильном ослаблении GVHD (48).

Хотя подавление передачи сигналов TCR может предотвратить GVHD, полное подавление ответов T-клеток сводит на нет положительный эффект GVL, который также обеспечивается теми же донорскими T-клетками после алло-HSCT (50).Тот факт, что мыши, которым трансплантировали Itk ^{— / —} Т-клетки, способны вызывать GVL-ответы, является захватывающим признаком. Сохранение ответа GVL могло произойти по нескольким причинам. Во-первых, пролиферация и цитотоксическая активность Itk ^{— / —} Т-клеток сохраняются по сравнению с производством провоспалительных цитокинов. На проявления и тяжесть РТПХ сильно влияют местные цитокины, которые затем активируют факторы транскрипции и подталкивают развитие к цитокиновому шторму.Кроме того, провоспалительные цитокины оказывают прямое действие на ткани-мишени GVHD (51–53). Действительно, наличие цитокинового шторма считается одним из отличительных признаков патогенеза GVHD (54), и наши данные показали, что продукция цитокинов была значительно снижена у мышей, которые получали Itk ^{— / —} Т-клеток. Мы также подтвердили, что производство цитокинов является внутренним для Т-клеток, в то время как пролиферация является внешней для Т-клеток. Чтобы изучить потенциальный механизм этой наблюдаемой разницы в экспрессии цитокинов и хемокиновых рецепторов между WT и Itk ^{— / —} донорскими CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетками, мы проанализировали ключевые факторы транскрипции и пути, которые могут быть задействованы. в этих процессах.Мы обнаружили значительные различия в экспрессии фактора транскрипции IRF4 и сигнальных путей JAK / STAT, которые регулируют экспрессию ключевых молекул, необходимых для поддержания эффекторной функции Т-клеток, продукции цитокинов и активации хемокиновых рецепторов. Поскольку было показано, что IRF4 играет критическую роль в модуляции силы сигнала TCR и функции Т-клеток (32), вполне вероятно, что снижение активации IRF4 и пути JAK / STAT способствует снижению экспрессии цитокинов, тем самым смягчая цитокиновый шторм при РТПХ (15).Наши данные показывают, что сниженная пролиферация, наблюдаемая в донорских Т-клетках от мышей Itk ^{— / —} , является клеточно-внешней. Ранее было показано, что дефицит ITK влияет на пролиферацию Т-клеток (54) и продукцию цитокинов, но во время аллогенной активации ITK-дефицитные Т-клетки все еще могут пролиферировать. Это может быть связано с избыточной функцией ITK и других киназ Tec (55). Это открытие согласуется с нашими данными по цитокинам, которые показывают, что Itk ^{— / —} Т-клетки продуцируют меньше цитокинов как в сыворотке, так и на клеточной основе.При трансплантации либо CD4 ⁺ , либо CD8 ⁺ Т-клеток в соотношении 1: 1 клеток WT: Itk ^{— / —} , мы наблюдали аналогичные уровни пролиферации как для WT, так и для Itk ^{— / —} донорских клеток. Таким образом, наши данные предоставляют дополнительные доказательства того, что на пролиферацию донорских Т-клеток влияют воспалительные состояния (56).

Все вместе наши данные показывают, что ослабление передачи сигналов TCR снижает продукцию цитокинов, опосредованную донорскими Т-клетками, что приводит к менее тяжелой РТПХ.Кроме того, неспособность Т-клеток мигрировать к органам-мишеням также может влиять на этот процесс и, таким образом, объясняет сниженную способность донорских Т-клеток Itk ^{— / —} вызывать РТПХ.

Заявление о доступности данных

Представление данных RNAseq было одобрено NCBI GEO под регистрационным номером GSE161160. Все данные будут доступны любому желающему.

Заявление об этике

Исследования с участием людей были рассмотрены и одобрены IRB net 1140566-4.Комитет по этике отказался от требования письменного информированного согласия на участие. Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Медицинским университетом SUNY Upstate и Корнельским университетом.

Вклад авторов

MM, WH, AS, QY, SD, AB и MK проводили эксперименты. WT, YC, JP и TG предоставили ценные реагенты. RH помогал с анализом данных, экспериментальным дизайном, научными обсуждениями и редактированием рукописей. WH, QY, AA, AB и MK разработали эксперименты, проанализировали данные и написали рукопись.Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Премия стипендиата Национального фонда крови для MK и национальных институтов здравоохранения (NIH LRP # L6 MD0010106 и AI130182 для MK, AI120701 и AI126814 для AA, R35ES028244 для AA и Гэри Пердью, AI129422 для AA и WH, и AI14622 и GM130555-sub6610 на WH).

Конфликт интересов

AA получает исследовательскую поддержку от 3M Corporation. WH получает исследовательскую поддержку от Mega Robo Technologies.

Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эта рукопись была выпущена в качестве препринта на сайте bioRxiv. bioRxiv 2020.07.15.204693; DOI: https://doi.org/10.1101/2020.07.15.204693(3). Мы благодарим всех сотрудников лабораторий Карими и Августа за полезные обсуждения.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.593863/full#supplementary-material

Дополнительный рисунок 1 | Itk ^{— / —} CD4 ⁺ Т-клетки демонстрируют ослабленную индукцию РТПХ по сравнению с Т-клетками дикого типа. (A) 10 × 10 ⁶ _TCD BM и 1 × 10 ⁶ очищенный WT или Itk ^{— / —} CD4 ⁺ Т-клетки трансплантировали облученным мышам BALB / c. (A) Мышей наблюдали на выживаемость, (B) изменений массы тела и ( C ) клиническую оценку в течение 70 дней после BMT.Для изменений веса и клинической оценки показан один представитель 2 независимых экспериментов (n = 3 мыши / группа только для BM; n = 5 экспериментальных мышей / группа для всех трех групп). Представлены значения p. Для статистического анализа использовали двусторонний дисперсионный анализ и критерий Стьюдента t .

Дополнительный рисунок 2 | IMP T-клеток недостаточно для эффекта GVHD. (A-C) Itk / Il4ra Т-клетки DKO и WT исследовали на экспрессию Eomes до и после трансплантации. (D) 2 × 10 ⁶ очищенных WT и Itk / Il4ra DKO CD8 ⁺ T и 1 × 10 ⁶ очищенных CD4 ⁺ Т-клеток были смешаны и трансплантированы вместе с 2 × 10 ⁵ первичных клеток B-ALL- luc + в облученных мышей BALB / c. Мышей-реципиентов BALB / c визуализировали с помощью IVIS 3 раза в неделю. Группа 1 получала 10 × 10 ⁶ _TCD BM отдельно ( _TCD BM). Вторая группа получала 10 × 10 ⁶ _TCD BM вместе с 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc клеток ( _TCD BM + B-ALL ^luc ).Третьей группе трансплантировали 10 × 10 ⁶ _TCD BM с 2 × 10 ⁶ очищенных (CD8 ⁺ и CD4 ⁺ ) от мышей WT и 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc клетки ( _TCD BM + B-ALL ^luc + WT CD8 + CD4). Четвертой группе трансплантировали 10 × 10 ⁶ _TCD BM и 2 × 10 ⁶ очищенных Т-клеток (CD8 ⁺ и CD4 ⁺ ) от Itk / Il4ra DKO вместе с 2 × 10 ⁵ B-ALL- luc клеток ( _TCD BM + B-ALL ^luc + Itk / Il4ra DKO CD8 ⁺ CD4).Животных-реципиентов наблюдали на выживаемость, (E), изменений веса и (F), клинических баллов. (G) Рост лейкозных клеток контролировали, как показано на фиг. 1, и показана количественная биолюминесценция. Показан один представитель 2 независимых экспериментов (n = 3 мыши / группа только для BM; n = 5 экспериментальных мышей / группа для всех трех групп. Группы выживания представляли собой комбинации всех экспериментов.

Дополнительный рисунок 3 | Itk ^{— / —} Т-клетки способны продуцировать цитокины.Очищенные WT и Itk ^{— / —} Т-клетки трансплантировали облученным мышам BALB / c. На 7 день донорские Т-клетки были заблокированы для экспрессии H-2K ^b , CD45.2 и CD45.1 и проанализированы на внутриклеточную экспрессию IFN-γ и TNF-α после стимуляции ex vivo с помощью PMA / иономицин. Данные нескольких экспериментов были объединены, и статистический анализ был выполнен с использованием двухфакторного дисперсионного анализа и теста Стьюдента t с представленными значениями p.

Дополнительный рисунок 4 | Количественный анализ экспрессии и фосфорилирования JAK / STAT и IRF.Количественный анализ вестерн-блотов с использованием Image Lab для нормализации до β-актина, данные 3 независимых экспериментов. (A) Фосфонирование и общее STAT3. (B) Фосфо и всего JAK1. (C) Фосфо и всего JAK2. (D) Итого IRF-4. Для статистического анализа использовали двухфакторный дисперсионный анализ и тест Стьюдента t , представлены значения p.

Дополнительный рисунок 5 | Количественный анализ тканей BLI. Для экспериментов по визуализации тканей алло-ТГСК выполняли с 10 × 10 ⁶ WT-лимфоцитов без Т-лимфоцитов и 1 × 10 ⁶ FACS-сортированных (A) CD8 ⁺ Т-клеток или (B) CD4 ⁺ Т-клеток (от мышей B6-luc или Itk ^{— / —} luc ) и биолюминесцентную визуализацию тканей выполняли, как описано ранее ²⁰ .Вкратце, через 5 минут после инъекции люциферина (10 мкг / г веса тела) отобранные ткани были подготовлены и визуализированы в течение 1 минуты. Данные визуализации были проанализированы и количественно определены с помощью программного обеспечения Living Image (Xenogen) и Igor Pro (Wave Metrics, Lake Oswego, OR).

Список литературы

1. Бримс Д.А., Ловенберг Б. Трансплантация аутологичных стволовых клеток в лечении взрослых с острым миелоидным лейкозом. Br J Haematol (2005) 130: 825–33. doi: 10.1111 / j.1365-2141.2005.05628.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

2.Тугуес С., Аморим А., Спат С., Мартин-Блондель Г., Шрейнер Б., Де Фео Д. и др. Болезнь трансплантат против хозяина, но не иммунитет трансплантат против лейкемии, опосредуется миелоидными клетками, лицензированными GM-CSF. Sci Transl Med (2018) 10. doi: 10.1126 / scitranslmed.aat8410

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Маммадли М., Хуанг В., Харрис Р., Султана А., Ченг Ю., Тонг В. и др. Подавление ITK дифференцирует GVT и GVHD в алло-HSCT. bioRxiv (2020) 2020.2007.2015.204693. doi: 10.1101 / 2020.07.15.204693

CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Бастьен Дж. П., Рой Дж., Рой, округ Колумбия. Селективное истощение Т-клеток для трансплантации аллогенных стволовых клеток, несоответствующих гаплотипам. Семин Онкол (2012) 39: 674–82. doi: 10.1053 / j.seminoncol.2012.09.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Ferrara JL. Сеть клинических испытаний трансплантации крови и костного мозга: прогресс со времени проведения симпозиума State of the Science Symposium 2007 г. Пересадка костного мозга Biol (2014) 20: 149–53. doi: 10.1016 / j.bbmt.2013.11.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Бликли М., Черепаха С.Дж., Ридделл С.Р. Повышение противоопухолевого иммунитета путем адоптивного переноса Т-клеток после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. Expert Rev Hematol (2012) 5: 409–25. doi: 10.1586 / ehm.12.28

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Август A, Садра A, Дюпон B, Ханафуса Х.Src-индуцированная активация индуцибельной Т-клеточной киназы (ITK) требует активности фосфатидилинозитол-3-киназы и домена гомологии плекстрина индуцибельной Т-клеточной киназы. Proc Natl Acad Sci USA (1997) 94: 11227–32. doi: 10.1073 / pnas.94.21.11227

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Qi Q, Sahu N, August A. Tec-киназа Itk образует мембранные кластеры, особенно вблизи рекрутирующих рецепторов. J Biol Chem (2006) 281: 38529–34.doi: 10.1074 / jbc.M60⁰⁰

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Атерли ЛО, Лукас Дж. А., Фелисес М., Инь С. К., Райнер С. Л., Берг Л. Дж.. Тирозинкиназы семейства Tec Itk и Rlk регулируют развитие обычных CD8 + Т-клеток. Иммунитет (2006) 25: 79–91. doi: 10.1016 / j.immuni.2006.05.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Линч Келли Д., Лион, Делавэр, Ameringer SA, Элсвик, РК. Симптомы, цитокины и качество жизни у пациентов с диагнозом «хроническая болезнь трансплантат против хозяина» после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Форум Онкол Нурс (2015) 42: 265–75. doi: 10.1188 / 15.ONF.265-275

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Дубовский Дж. А., Флинн Р., Ду Дж., Харрингтон Б. К., Чжун Ю., Каффенбергер Б. и др. Лечение ибрутинибом улучшает хроническое заболевание мышей «трансплантат против хозяина». Дж. Клин Инвест (2014) 124: 4867–76. doi: 10.1172 / JCI75328

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Хуанг В., Хуанг Ф., Каннан А.К., Ху Дж., Август А.ITK настраивает индуцированное IL-4 развитие CD8 + Т-клеток врожденной памяти в зависимости от гаммадельта-Т и инвариантных NKT-клеток. J Leukoc Biol (2014) 96: 55–63. doi: 10.1189 / jlb.1AB0913-484RR

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Мудтер Дж., Ю. Дж., Амуссина Л., Вейгманн Б., Хоффман А., Рюкнагель К. и др. IRF4 избирательно контролирует экспрессию генов цитокинов при хроническом воспалении кишечника. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) (2009) 57: 369–76.DOI: 10.1007 / s00005-009-0046-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Cheng Y, Chikwava K, Wu C, Zhang H, Bhagat A, Pei D, et al. LNK / Sh3B3 регулирует передачу сигналов рецептора IL-7 в нормальных и злокачественных B-предшественниках. Дж. Клин Инвест (2016) 126: 1267–81. doi: 10.1172 / JCI81468

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Эдингер М., Хоффманн П., Эрманн Дж., Драго К., Фатман К.Г., Стробер С. и др. CD4 + CD25 + регуляторные Т-клетки сохраняют активность трансплантат против опухоли, одновременно подавляя реакцию трансплантат против хозяина после трансплантации костного мозга. Nat Med (2003) 9: 1144–50. DOI: 10.1038 / nm915

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Cooke KR, Kobzik L, Martin TR, Brewer J, Delmonte Jr., Crawford JM, et al. Экспериментальная модель синдрома идиопатической пневмонии после трансплантации костного мозга: I. Роль минорных антигенов H и эндотоксина. Кровь (1996) 88: 3230–9. doi: 10.1182 / blood.V88.8.3230.bloodjournal8883230

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21.Beilhack A, Schulz S, Baker J, Beilhack GF, Wieland CB, Herman EI, et al. Анализ in vivo ранних событий при острой болезни «трансплантат против хозяина» показывает последовательную инфильтрацию субпопуляций Т-клеток. Кровь (2005) 106: 1113–22. doi: 10.1182 / blood-2005-02-0509

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Карими М.А., Ли Э., Бахманн М.Х., Салициони А.М., Беренс Е.М., Камбаяши Т. и др. Измерение цитотоксичности с помощью биолюминесцентного изображения превосходит стандартный анализ высвобождения хрома-51. PloS One (2014) 9: e89357. doi: 10.1371 / journal.pone.0089357

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Амир А.Л., Хагедорн Р.С., ван Люксембург-Хейс SAP, Марийт ЭВА, Круиссельбринк А.Б., Фалькенбург Дж. Х. Ф. и др. Идентификация скоординированного ответа CD8 и CD4 Т-клеток, направленного против несовпадающего HLA класса I, вызывающего тяжелую острую болезнь трансплантат против хозяина. Пересадка костного мозга Biol (2012) 18: 210–9. doi: 10.1016 / j.bbmt.2011.10.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24.Yu XZ, Albert MH, Anasetti C. Аффинность аллоантигена и CD4 помогают определить тяжесть реакции «трансплантат против хозяина», опосредованной донорскими Т-клетками CD8. J Immunol (2006) 176: 3383–90. doi: 10.4049 / jimmunol.176.6.3383

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Ву Т., Янг Дж. С., Джонстон Х., Ни Х, Дэн Р., Расин Дж. И др. Повреждение тимуса, нарушение отрицательной селекции и развитие хронической реакции «трансплантат против хозяина», вызванной донорскими CD4 + и CD8 + Т-клетками. J Immunol (2013) 191: 488–99.doi: 10.4049 / jimmunol.1300657

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Хуанг В., Ху Дж., Август А. Передний край: CD8 + Т-клетки врожденной памяти отличаются от гомеостатических расширенных CD8 + Т-клеток и быстро реагируют на первичные антигенные стимулы. J Immunol (2013) 190: 2490–4. doi: 10.4049 / jimmunol.1202988

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Weinreich MA, Odumade OA, Jameson SC, Hogquist KA. Т-клетки, экспрессирующие фактор транскрипции PLZF, регулируют развитие подобных памяти CD8 + Т-клеток. Nat Immunol (2010) 11: 709–16. doi: 10.1038 / ni.1898

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Карти С.А., Корецкий Г.А., Иордания М.С. Интерлейкин-4 регулирует эомезодермин в развитии и дифференцировке CD8 + Т-клеток. PloS One (2014) 9: e106659. doi: 10.1371 / journal.pone.0106659

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Пиковская О., Чаикс Дж., Ротман Н.Дж., Коллинз А., Чен Ю.Х., Сципиони А.М. и др.Передний край: эомезодермин достаточен, чтобы направить развитие врожденных лимфоцитов 1 типа в обычную линию NK. J Immunol (2016) 196: 1449–54. doi: 10.4049 / jimmunol.1502396

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Д’Авени М., Россиньол Дж., Коман Т., Сивакумаран С., Хендерсон С., Манзо Т. и др. G-CSF мобилизует регуляторные моноциты CD34 +, которые ингибируют реакцию «трансплантат против хозяина». Sci Transl Med (2015) 7: 281ra242. DOI: 10.1126 / scitranslmed.3010435

CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Цанг Дж.Й., Камара Н.О., Эрен Э., Шнайдер Х., Радд К., Ломбарди Дж. И др. Измененная передача сигналов проксимального Т-клеточного рецептора (TCR) в человеческих CD4 + CD25 + регуляторных Т-клетках. J Leukoc Biol (2006) 80: 145–51. doi: 10.1189 / jlb.0605344

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Бисвас П.С., Гупта С., Чанг Э., Сонг Л., Стирзакер Р.А., Ляо Дж. К. и др. Фосфорилирование IRF4 с помощью ROCK2 регулирует продукцию IL-17 и IL-21 и развитие аутоиммунитета у мышей. Дж. Клин Инвест (2010) 120: 3280–95. doi: 10.1172 / JCI42856

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Йи Дж, Чэнь З., Сюй Ф., Ван З., Чжан А., Лю Т. и др. IL-27 способствует способности мезенхимальных стромальных клеток человека, полученных из плаценты, индуцировать образование CD4 (+) IL-10 (+) IFN-gamma (+) T-клеток посредством пути JAK / STAT при лечении экспериментального трансплантата вместо — Болезнь хозяина. J Immunol (2019) 202: 1124–36. doi: 10.4049 / jimmunol.1800963

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35.Lu SX, Holland AM, Na IK, Terwey TH, Alpdogan O, Bautista JL и др. Отсутствие Р-селектина у реципиентов аллогенной трансплантации костного мозга улучшает экспериментальную реакцию «трансплантат против хозяина». J Immunol (2010) 185: 1912–9. doi: 10.4049 / jimmunol.08

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Cho HS, Ha S, Shin HM, Reboldi A, Hall JA, Huh JR, et al. CD8 (+) Т-клетки требуют передачи сигналов TCR, опосредованной ITK, для миграции в кишечник. Иммунохоризонты (2020) 4: 57–71.doi: 10.4049 / immunohorizons.1

3

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Высоцкий К.А., Беркетт С.Б., Паноскальцис-Мортари А., Кирби С.Л., Блеск А.Д., Маккиннон К. и др. Дифференциальная роль экспрессии CCR5 на донорских Т-клетках во время реакции «трансплантат против хозяина» на основе предпосылок кондиционирования. J Immunol (2004) 173: 845–54. doi: 10.4049 / jimmunol.173.2.845

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Сеиф Ф., Хошмирсафа М., Аазами Х., Мохсензадеган М., Седиги Г., Бахар М.Роль сигнального пути JAK-STAT и его регуляторов в судьбе Т-хелперных клеток. Сигнал Cell-Commun (2017) 15:23. doi: 10.1186 / s12964-017-0177-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Чой Дж., Зига Э.Д., Ричи Дж., Коллинз Л., Прайор Дж. Л., Купер М.Л. и др. Передача сигналов IFNgammaR опосредует транспорт аллореактивных Т-клеток и GVHD. Кровь (2012) 120: 4093–103. doi: 10.1182 / blood-2012-01-403196

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41.Чой Дж., Купер М.Л., Алахмари Б., Ричи Дж., Коллинз Л., Холт М. и др. Фармакологическая блокада JAK1 / JAK2 снижает GvHD и сохраняет эффект трансплантата против лейкемии. PloS One (2014) 9: e109799. doi: 10.1371 / journal.pone.0109799

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Вильярроэль В.А., Окияма Н., Цудзи Г., Линтон Дж. Т., Кац С. И.. CXCR3-опосредованный кожный хоминг аутореактивных CD8 Т-клеток является ключевым детерминантом мышиной реакции «трансплантат против хозяина». J Invest Dermatol (2014) 134: 1552–60.doi: 10.1038 / jid.2014.2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Лю В., Рен Х-И, Донг И-Дж, Ван Л-Х, Инь И, Ли И и др. Бортезомиб регулирует хемотаксические характеристики Т-клеток путем подавления экспрессии CXCR3 / CXCL9 и индукции апоптоза. Int J Hematol (2012) 96: 764–72. doi: 10.1007 / s12185-012-1195-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Murai M, Yoneyama H, Ezaki T., Suematsu M, Terashima Y, Harada A, et al.Пластырь Пейера является важным участком в инициировании острой и летальной реакции трансплантат против хозяина у мышей. Nat Immunol (2003) 4: 154–60. doi: 10.1038 / ni879

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Terwey TH, Kim TD, Kochman AA, Hubbard VM, Lu S, Zakrzewski JL, et al. CCR2 необходим для CD8-индуцированной болезни трансплантат против хозяина. Кровь (2005) 106: 3322–30. doi: 10.1182 / blood-2005-05-1860

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46.He S, Cao Q, Qiu Y, Mi J, Zhang JZ, Jin M и др. Новый подход к блокированию опосредованной аллореактивными Т-клетками реакции трансплантат против хозяина путем введения in vivo нейтрализующего антитела против CXCR3. J Immunol (2008) 181: 7581–92. doi: 10.4049 / jimmunol.181.11.7581

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Даффнер У., Люк Б., Хильдебрандт Г.К., Тешима Т., Уильямс Д.Л., Редди П. и др. Роль CXCR3-индуцированной миграции донорских Т-клеток в острой GVHD. Exp Hematol (2003) 31: 897–902.doi: 10.1016 / S0301-472X (03) 00198-X

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Вадакеколату Дж., Рутелла С. Стратегии манипуляции с Т-клетками для предотвращения болезни «трансплантат против хозяина» при гаплоидентичной трансплантации стволовых клеток. Биомедицина (2017) 5 (2): 33. doi: 10.3390 / biomedicines5020033

CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Сато Т., Торласиус Х., Джонстон Б., Статон Т.Л., Сян В., Литтман Д.Р. и др. Роль CXCR6 в привлечении активированных лимфоцитов CD8 + в воспаленную печень. J Immunol (2005) 174: 277–83. doi: 10.4049 / jimmunol.174.1.277

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Vaeth M, Bäuerlein CA, Pusch T., Findeis J, Chopra M, Mottok A, et al. Селективное нацеливание NFAT в Т-лимфоциты уменьшает GvHD, сохраняя противоопухолевую активность. Proc Natl Acad Sci U S A (2015) 112: 1125–30. DOI: 10.1073 / pnas.14092

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Хилл Г.Р., Кроуфорд Дж. М., Кук К. Р., Бринсон Ю. С., Пан Л., Феррара Дж. Л. М..Облучение всего тела и острая болезнь трансплантат против хозяина: роль желудочно-кишечных повреждений и воспалительных цитокинов. Кровь (1997) 90: 3204–13. doi: 10.1182 / blood.V90.8.3204

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Мохти М., Блейз Д., Фаучер К., Вей Н., Буабдалла Р., Стоппа А.М. и др. Воспалительные цитокины и острая реакция «трансплантат против хозяина» после кондиционирования аллогенной трансплантации стволовых клеток пониженной интенсивности. Кровь (2005) 106: 4407–11.doi: 10.1182 / blood-2005-07-2919

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Ju XP, Xu B, Xiao ZP, Li JY, Chen L, Lu SQ и др. Экспрессия цитокинов во время острой реакции «трансплантат против хозяина» после трансплантации аллогенных периферических стволовых клеток. Пересадка костного мозга (2005) 35: 1179–86. doi: 10.1038 / sj.bmt.1704972

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

56. Шеффер Э.М., Дебнат Дж., Яп Дж., Маквикар Д., Ляо XC, Литтман Д. Р. и др.Потребность в Tec-киназах Rlk и Itk для передачи сигналов рецептора Т-клеток и иммунитета. Science (1999) 284: 638–41. DOI: 10.1126 / science.284.5414.638

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

East Hill Boutique — gvl ENTHUSIAST

В то время как некоторые бутики могут стать виновниками того, что из-за нехватки места всю одежду разбивают в несколько рядов, я нашел East Hill удобным местом для покупок. Кусочки были аккуратно разложены и легко снимались со стоек.Такой тип удобства делает покупки более органичными, чем копание в переполненных стеллажах. Я направился прямо к уголку модных футболок с надписями типа «поздний завтрак» и «малышки поддерживают малышек» спереди. Я схватил рубашку с «хорошими флюидами» и помолился, чтобы она подошла именно так, чтобы я могла снять свой овечий свитер. Я примерила несколько свитеров со звездами, но звезды не подошли идеально. (Видите, что я там делал? Да, я горжусь этим.) Оглядываясь назад, можно сказать, что в одном месте было немного излишка звездных свитеров, но звезды сейчас настолько модны, что я не могу их винить.Я примерила пару комбинезонов, которые тоже не подошли, но рубашка с надписью «good vibes» подошла отлично и соответствовала всем требованиям. Я практически вышел из примерочной и сказал: «Я хочу купить это и не хочу снимать». Стилист (которая оказывается совладельцем заведения со своей мамой) согласилась, позвонила мне и отрезала ярлык для меня.

Я еще раз огляделась и тяготела к их подарочным вещам, таким как эта кружка суеты и журналы «Женская повестка дня», но, поскольку у меня не было особого смысла в этом, я подошла к столу для украшений.Серьги — моя слабость, и я выбрала пару деревянных спиральных вещей, которые несколько соответствовали монохрому рубашки. Это была моя вторая покупка, и я поменяла их на серьги, которые уже носила. С этими серьгами мои мочки действительно направили мою внутреннюю Леди Свободу.

Технически рубашка и серьги не подходили к серым леггинсам и темно-синим кроссовкам, которые я носил в тот день, но погода требовала этого, и мне было намного удобнее. Я планирую носить эти серьги с чем-то более нарядным в будущем, но мне нравится их прихоть с рубашкой.Вы никогда не ошибетесь с хорошими флюидами, так что поздоровайтесь с моей футболкой «каждую субботу на всю оставшуюся жизнь».

Механизм реакции превращения γ-валеролактона (GVL) на Ru катализатор: исследование первых принципов (журнальная статья)

Бабабрик, Реда М., Ван, Бин и Ресаско, Дэниел Э. Механизм реакции превращения γ-валеролактона (GVL) через катализатор Ru: исследование первых принципов. США: Н. П., 2017. Интернет.https://doi.org/10.1021/acs.iecr.7b00196.

Бабабрик, Реда М., Ван, Бин и Ресаско, Дэниел Э. Механизм реакции превращения γ-валеролактона (GVL) через катализатор Ru: исследование первых принципов. Соединенные Штаты. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.7b00196

Бабабрик, Реда М., Ван, Бин и Ресаско, Дэниел Э.Пн. «Механизм реакции превращения γ-валеролактона (GVL) над Ru катализатором: исследование первых принципов». Соединенные Штаты. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.7b00196. https://www.osti.gov/servlets/purl/1775283.

@article {osti_1775283,
title = {Механизм реакции превращения γ-валеролактона (GVL) в Ru катализатор: исследование первых принципов},
author = {Bababrik, Reda M.and Wang, Bin and Resasco, Daniel E.},
abstractNote = {Превращение полученного из биомассы γ-валеролактона (GVL) в ценные химические вещества широко изучалось, и понимание механизма реакции очень ценно для повышения скорости оборота и селективности. Здесь мы сообщаем о расчетах функционала плотности из первых принципов, посредством которых мы подробно показываем пути реакции превращения GVL на поверхности Ru (0001), что хорошо согласуется с недавними экспериментальными результатами, выполненными на нанесенных Ru катализаторах.Мы обнаружили, что (i) GVL довольно легко подвергается реакции раскрытия цикла и (ii) лимитирующая стадия образования 1,4-пентандиола (1,4-PDO) и 2-пентанола (2-PeOH). стадия гидрирования. Высокий энергетический барьер для этой стадии вызван сильным взаимодействием между Ru и ненасыщенным ацильным промежуточным соединением, которое образуется после раскрытия кольца. Среди всех первичных продуктов образование 2-бутанола (2-BuOH) имеет наименьший активационный барьер, в то время как самая медленная стадия - это разрыв связи C – C на стадии декарбонилирования.Здесь мы также показываем, что то же самое ацильное промежуточное соединение после раскрытия цикла GVL также может быть образовано дегидрированием 1,4-PDO с умеренным активационным барьером, что предполагает, что как 2-PeOH, так и 2-BuOH могут также образовываться во вторичном steps.},
doi = {10.1021 / acs.iecr.7b00196},
journal = {Industrial and Engineering Chemistry Research},
number = 12,
volume = 56,
place = {United States},
year = { 2017},
мес. = {3}
}

3’s Greenville Golf & Grill

3’s Greenville Golf & Grill | Любимый Пар 3 северных штатов!

3’s Greenville Golf & Grill — это новая концепция, способная покорить север штата и мир гольфа.Полностью отремонтированное поле для гольфа пар 3 теперь открыто для игры на лужайке, ранее известной как CrossWinds Par 3, с 12 уникальными и сложными лунками, спроектированными некоторыми из ведущих мировых архитекторов полей для гольфа. Вас приглашают пообщаться с нами и насладиться новым дизайном блюд и травами, а также вкусной едой, вином и коктейлями, которые подаются с подлинным южным гостеприимством в непринужденной непринужденной атмосфере, не похожей ни на что другое в городе.

Забронируйте время для игры в футбол онлайн, и вы готовы к веселью в 3’s Greenville Golf & Grill.Бронирование принимается как для одиночных игроков, так и для групп до четырех человек. Раунд на 12 лунок стоит 28 долларов США (включая налоги) каждый день для взрослых. Senior (возраст 60+) и Junior (возраст 17 и младше): 17,50 долларов США (включая налоги) с понедельника по пятницу до 17:00. Позвоните в Pro Shop по телефону 864.233.6336.

Забронируйте свою футболку сейчас

TGIF Ближайшие к дыре Счастливый час

Каждую пятницу с 17:00 до 19:00

Отличные коктейли и специальные предложения на напитки в «счастливый час», еда, друзья и развлечения!

• За 5 долларов вы получите 2 мяча за ближайший к дыре.Нет ограничений на то, сколько раз вы можете участвовать или сколько недель вы можете выиграть. Каждый вступительный взнос идет в банк.
• Каждую неделю половина банка будет присуждаться победителю конкурса «Ближайшие к лунке в пятницу». Другая половина попадет в прогрессивный банк для захватывающего события «Финал сезона , ближайший к лунке », где победитель получит ВСЕ!
• Каждый победитель недели имеет право на серию буллитов в конце сезона. Во время серии буллитов эти квалификационные игроки получат по одному мячу за каждую выигранную неделю в течение сезона.Помните, что вы можете участвовать сколько угодно раз в неделю!
• Вам не обязательно быть отличным игроком в гольф, чтобы участвовать … кто знает, вы можете сделать удачный удар и стать победителем на этой неделе!

До встречи!

Поделитесь радостью от 3’s Greenville Golf & Grill с друзьями и семьей с подарочной картой, которая подходит для игры в гольф, еды, напитков и нашего знаменитого гостеприимства. Теперь можно приобрести в любое время и в любой сумме лично в нашем клубе 3’s по адресу 61 Villa Road в Гринвилле. Прекрасный подарок на любой случай; праздники, дни рождения, юбилеи, работа или отдых. Лучше всего, что он универсален, доступен только одного цвета и никогда не выходит из моды!

Узнать о подарочных картах 3

3’s Greenville Golf & Grill открыт для публики, что включает в себя доступ к полю для гольфа, тренировочной зоне для коротких игр, 18-луночному полю для гольфа Humps & Bumps, столовой и всем удобствам. Мы также предлагаем членство , которое предоставляет гостям и их ближайшим родственникам особые льготы, скидки и льготы, которые делают его очень выгодным. В рамках специального предложения к торжественному открытию первые 100 участников получают 10 индивидуальных бесплатных раундов в гольф!

Подробнее о преимуществах для участников

Каждый четверг в 18:00

15 апреля — 26 августа

Готовы сыграть в Spark Golf?

Spark — это 9-луночная социальная лига по гольфу, организованная для непринужденной и веселой игры с легким дружеским соревнованием. Spark объединяет людей, чтобы играть в гольф. Наша цель — сделать Spark Golf более увлекательным, социальным и организованным, чем ваш ежедневный раунд игры в гольф.Мы хотим, чтобы вы больше играли в гольф и отлично проводили время каждый четверг в 18:00 с 15 апреля по 26 августа в 3’s Greenville. #playparkgolf

Присоединение к лиге бесплатное!

Присоединяйтесь бесплатно, играйте всего за 29 долларов за раунд. Раунды лиги доступны для покупки каждую неделю, или вы можете сэкономить, предварительно оплатив 9 или 18 раундов.

Присоединяйтесь как команда из двух человек или как один.

Играйте так, как позволяет ваше расписание, зарабатывая очки в зависимости от того, как вы заканчиваете каждый раунд в течение сезона. А главное, получайте удовольствие!

Удобство и гибкость
20 доступных раундов с 15 апреля по 26 августа в 3’s Greenville.Играйте столько или меньше, сколько позволяет ваше расписание.
Общайтесь с другими
Зарегистрируйтесь как команда из 2 человек или как одиночка. Мы свяжем вас с партнером, если у вас его нет, так что выходите.
Для игроков любого уровня подготовки
Открыт для всех любителей гольфа, желающих развлечься. Предоставлены инвалиды. Нет необходимости в наличии гандикапа.
Товарищеские соревнования
Победители одного раунда и сезона. Играйте в веселой и общительной атмосфере, созданной для обычного игрока в гольф.

Записывается на лето 2021 года

ПОЛУДНЕВНЫЕ ЛАГЕРЯ для детей 7-13 лет

14-18 июня / 12-16 июля / 2-6 августа

9:00 — 12:00

Директор лагеря: Брайан Пиплс , PGA

Стоимость: 295 долларов США

Обратите внимание: в стоимость лагеря не входит невозвращаемый ежегодный регистрационный взнос в размере 15 долларов США.

Зарегистрируйтесь сейчас

Это не просто гольф-лагерь. Это детский гольф-лагерь PGA.

Юношеские гольф-лагеря PGA принимают участников на лето 2021 года! Получите максимум удовольствия от летних каникул, зарегистрировавшись в гольф-лагере PGA Junior Golf Camp, где вы будете поражены тем, насколько увлекательным может быть гольф.

PGA Junior Golf Camps обучают основам игры в увлекательной и увлекательной обстановке, включая полный размах, короткую игру, правила и обучение этикету. Что еще более важно, в лагерях делается упор на развитие навыков и развлечение, так как они включают игры как на поле, так и вне его. Если вы хотите освоить новый вид спорта или улучшить и посоревноваться в турнирах, наши профессиональные инструкторы PGA приглашают вас принять участие в игре!

• Активные лагеря включают практические занятия под руководством сертифицированных профессионалов PGA.
Учебная программа лагеря
• Signature PGA направлена ​​на развитие навыков игры в гольф (полный ход, короткая игра, правила и этикет), сохраняя при этом увлекательность и увлекательность (игры и мероприятия).
• Веселая, безопасная и образовательная среда, созданная с заботой о благополучии вашего ребенка.
• Низкое соотношение студентов и преподавателей (примерно 6: 1).

Полудневные лагеря призваны вдохновлять новых игроков в гольф и способствовать развитию тех, кто играет от новичка до среднего уровня.Участники делятся на более мелкие группы в зависимости от их опыта и возраста, чтобы создать благоприятную среду обучения. В течение трех часов каждый день участники лагеря учатся и оттачивают свои навыки, уделяя при этом особое внимание основам гольфа, получая при этом удовольствие!

Инструкторы

Чтобы быть лучшим, вы должны учиться у лучших. Вот почему каждый инструктор лагеря для юных гольфистов прошел обучение и тестирование по всем аспектам игры Американской ассоциацией гольфистов. Наше обещание — поддерживать, поощрять и уважать каждого из наших отдыхающих и искренне вдохновлять их полностью раскрыть свой потенциал как на поле для гольфа, так и за его пределами.

Для получения дополнительной информации о гольф-лагере PGA Junior Golf Camp в 3’s Greenville этим летом, свяжитесь с нами сегодня по телефону 864.233.6336 или . Нажмите здесь, чтобы отправить нам электронное письмо для получения дополнительной информации. Узнайте больше о программах PGA на сайте PGAJuniorGolfCamps.com или позвоните по телефону 888.PGA.PLAY.

Приходите в 3’s Greenville и насладитесь нашими освежающими коктейлями после работы или после тренировки на трассе. Или попробуйте некоторые из наших вкусных блюд, которые подаются в горячем виде от нашего нового курильщика на открытом воздухе, включая такие популярные, как гамбургеры, тако с креветками, бутерброды со свининой, хот-доги и многое другое.

Посмотреть наше меню еды и напитков

домов для отпуска и домов в Гринвилле — Южная Каролина, США

домов для отпуска и домов в Гринвилле — Южная Каролина, Соединенные Штаты | AirbnbПропустить к содержанию

Сожалеем, некоторые части веб-сайта Airbnb не работают должным образом без включенного JavaScript.

Найдите и забронируйте уникальное жилье на Airbnb

Аренда на время отпуска в Гринвилле с самым высоким рейтингом

Гости соглашаются: эти варианты проживания высоко ценятся за расположение, чистоту и многое другое.

Гостевой люкс целиком · 2 гостя · 1 кровать · 1 ванная

★ СОЗДАН НА ЗАКАЗ ★ Downtown Garage Studio Loft AptНаша новая квартира в гараже была построена нами на заказ для Airbnb! Завершено в конце 2018 года. В нем есть все необходимое для комфортного приключения вдали от дома. У нас есть быстрый доступ к центру города Гринвилл и Парку водопадов (<2 миль), и мы расположены в нескольких минутах ходьбы от улицы Огаста и Мемориальной больницы Гринвилла. Отдельный вход, выделенное парковочное место, высокоскоростной Интернет, YouTube TV, полностью оборудованная кухня и ванная комната.Добро пожаловать в процветающий город ГВЛ!

Гостевой дом целиком · 4 гостя · 2 кровати · 1 ванная

Beautiful Garage Studio Near Downtown GreenvilleGarage Квартира-студия в 2,4 км от центра города Гринвилл, в 0,8 км от больницы Prisma Health / Greenville Memorial. Уютная студия для 4 человек с кроватью размера «queen-size» и футоном размера «queen-size». На мини-кухне есть небольшой холодильник, микроволновая печь, тостер и кофеварка. Телевизор с 65-дюймовым экраном, Hulu, Netflix + высокоскоростной Интернет. Отдельный вход в задней части гаража и просторная парковка.Не включает доступ к закрытому двору главного дома.

Кондоминиум целиком · 4 гостя · 2 кровати · 1 ванная

LUXURY MAIN ST. КОНДО С БАЛКОНОМ Без платы за уборку Если вы ищете первоклассный отдых в Гринвилле, это место для вас. Эта удивительная главная улица. В номере есть большой балкон с диванами напротив, чтобы вы могли погрузиться в атмосферу центра города. Все апартаменты были отремонтированы в 2019 году и обставлены новой мебелью. Это однокомнатная квартира с полностью открытой планировкой.В спальной зоне расположена большая двуспальная кровать с роскошным постельным бельем. В этом номере-студио могут разместиться 2 дополнительных гостя с диваном-кроватью размера «queen-size». Он расположен в самом центре города!

Аренда на любой вкус

Получите пространство, которое подходит именно вам

• Дома

  Комфортные места со всем необходимым

• Отели

  Стильные номера и удобства

• Уникальное проживание

  Пространства, которые больше, чем просто место для сна

Популярные удобства для аренды на время отпуска в Гринвилле

Другая отличная аренда на время отпуска в Гринвилле

1. Вся квартира
2. · Гринвилл

Северная улица Наверх — Гараж, кв.

1. Таунхаус целиком
2. · Гринвилл

Кондоминиум с частным входом на первом этаже * Без платы за уборку *

100 долларов за ночь

100 долларов за ночь

1. Дом целиком
2. · Гринвилл

Любовь растет здесь Дом

1. Весь кондоминиум
2. · Гринвилл

NEW Chic Downtown Gem САНИТИЗИРОВАННАЯ (бесплатная парковка)

134 $ / ночь

134 $ за ночь

1. Дом целиком
2. · Гринвилл

Коттедж на краю Северного Мэйна

1. Квартира целиком
2. · Гринвилл

КВАРТИРА ПРЕМИУМ В ЦЕНТРЕ, 1 БЛОК ОТ ГЛАВНОГО БЛОКА B

1. Кондоминиум целиком
2. · Гринвилл

Современная квартира в центре Гринвилля

$ 190 / ночь

$ 19099 за ночь 967 967 999 $ 19099 за ночь · Simpsonville

East Curtis Cottage — Downtown Simpsonville Gem !

119 $ за ночь

119 $ за ночь

1. Дом целиком
2. · Гринвилл

Уют, комфорт: 2 мили от центра города и больниц

1. Квартира целиком
2. · Гринвилл

Дуплекс 2-го уровня — 2 минуты от Main St

1. Гостевой дом целиком
2. · Greenville

Biltmore Suite — Совершенно новый, очищенный / продезинфицированный

1. Отдельная комната
2. · Greenville

Уютная комната № 1 в Chez Anne

Самые популярные вещи в do in Greenville

Уникальные мероприятия, организованные местными экспертами, прошедшими проверку на качество

• Ковка на ферме Quiver Full

  Ваше кузнечное приключение будет включать три часа ручных инструктажей, когда вы создадите свой собственный шедевр.Ваш опыт начнется с краткого ознакомления с The Forge at Quiver Full Farm. Во время ориентации мы позаботимся о том, чтобы каждый участник был одет и подготовлен со всем необходимым оборудованием для БЕЗОПАСНОЙ ковки. Мы будем работать с оборудованием, которое достигает температуры выше 1800 градусов по Фаренгейту. Этот опыт требует от участников быть внимательными и уметь физически напрягать себя. Перед началом мы попросим всех участников подписать отказ от ответственности за безопасность.Если вам меньше 18 лет, для участия вас должен сопровождать родитель или опекун. Джереми познакомит вас со всем оборудованием, которое вы будете использовать при создании своего кованого изделия. Он даст подробная и управляемая инструкция по использованию этих инструментов. Оттуда вы выберете один из четырех проектов для создания. Джереми будет рядом, чтобы направлять вас, помогать и поддерживать безопасную рабочую среду, пока вы создаете свой шедевр. Другие заметки Этот опыт предназначен для взрослых и детей старше 14 лет.Если у вас есть чувствительность к дыму и жаре, это может быть не для вас.

  От Цена: 135 долларов на человека

• Тур по водопадам и горным вершинам

  Мы начнем в самом центре Гринвилла, в парке Фолс. Здесь мы сделаем снимки перед водопадом и на знаменитом подвесном мосту, который нависает над водопадом. После нескольких фотографий в парке мы отправимся в Пикенс, Южная Каролина, для нашей первой остановки дня. Сначала мы остановимся в Coyote Coffee — лучшей кофейне в северной части штата! После быстрой остановки мы продолжим путь к горе Гласси, откуда открывается прекрасный вид на настоящую сельскую местность Каролины.Здесь мы сделаем фотографии и немного пообщаемся, прежде чем отправиться в Твин-Фоллс. Наша вторая остановка — двойной водопад с прекрасным маленьким бассейном, в который могут войти гости. Здесь мы будем проводить большую часть времени, играя в водопады и исследуя окрестности. Гости могут пройти по тропе к вершине водопада, где я сделаю для них несколько эпических фотографий. После наслаждения водопадом мы закончим наш тур на Лысой скале, где мы пообедаем. После Bald Rock мы вернемся в центр города Гринвилл.Другие заметки Обязательно носите удобную одежду для прогулок и активного отдыха. Мы будем путешествовать примерно в 45 минутах от города, поэтому, если у вас есть какие-либо особые потребности в поездке, сообщите мне.

  От Цена: 60 ​​$ / чел.

• Субботний тур с завтраком

  Во время субботнего тура с завтраком мы совершим поездку по центру Гринвилла и посетим одни из лучших местных заведений для завтрака. Вы узнаете историю Темного угла, как он появился и как он повлиял на Гринвилл до сих пор.Другая интересная историческая информация будет поделена вместе с сюжетом «Мыши на главном». Возможно, мы даже увидим мышей в нашем туре! Во время тура вам подадут три основных блюда на завтрак, которые включают: французские блины с яичницей и беконом; французские тосты из булочки с корицей с фруктовым компотом и колбасой; и креветки, и крупа … доверьтесь южному восторгу! Вкусный от начала до конца, и вы будете сыты в конце этого тура. Обедать не нужно. В конце этого тура у вас будет более близкое представление о Гринвилле и его красивом центре города.Другие заметки Тур представляет собой пешеходную экскурсию со всеми локациями на очень небольшом расстоянии друг от друга. Если есть пищевая аллергия или диетические ограничения, сообщите нам об этом за 48 часов до тура.

  От Цена: 65 долларов США на человека

• Create A Signature Fragrance

  Как опытный парфумолог из Tijon Fragrance Lab, я проведу вас через опыт создания индивидуального аромата в комфорте моего дома в Пельцере, Южная Каролина, примерно 1 / 2 часа к югу от Гринвилля, Южная Каролина.И мужчинам, и женщинам нравится этот творческий и веселый опыт! Если вы не видите подходящего для вас времени занятий, свяжитесь со мной, и мы создадим его! Covid Update — я разместил опыт на моем открытом первом этаже, чтобы позволить социальное дистанцирование. Я ограничиваю количество уроков до 6, поэтому есть место для дистанции. Маски на ваше усмотрение. Предоставляется дезинфицирующее средство для рук. Я буду предоставлять: — лабораторные халаты для ношения во время занятий — Более 60 масел для создания собственных духов или одеколонов — Изготовленная на заказ бутылка, этикетка и красивый велюровый мешочек. — Сохранение вашей специальной формулы, если вы решите изменить заказ Вы будете надевать лабораторный халат и получать удовольствие от создания собственного аромата, предварительно сделав три попытки.Представьте себе мужской одеколон с ароматом кожи и табачного масла или женский парфюм с чудесными ароматами Южной Каролины, такими как магнолия, персик и жасмин? Выбрав свою любимую формулу, вы закончите создавать свой собственный аромат и назовете его! Вы получите свой флакон (55 мл) с ароматом ручной работы, который заберете домой в красивом велюровом мешочке. Создание собственного аромата — уникальная возможность.

  От Цена: $ 69 / чел.

• Субботний коктейльный тур по ремеслу

  Мы начнем наш тур в Maestro Bistro, где наш первый коктейль будет парным. с восхитительной закуской от шеф-повара.Наша следующая остановка — одна из знаменитых мексиканских тусовок Гринвилла, где подают вкусные маргерита, Dirty Queso, трес-дип с жареным картофелем …. оле! Когда мы сделаем шаг назад во времени по соседству с чудесным Чарльстонским рестораном в Сассафрасе — их еда южная с французскими нотками, вам понравится прекрасная атмосфера и впечатления, которые будут предоставлены в этом месте. Мы заканчиваем вкусным мартини и десертом в Roost … восхитительное завершение чудесного вечера! Порции щедрые ….как прогрессивный ужин. Другие заметки Наденьте удобную обувь, возьмите с собой зонтик на случай дождя, если вы собираетесь позвонить в Uber, чтобы забрать вас …. последний адрес: 220 North Main, Hyatt Hotel

  От Цена: $ 85 / чел.

Ближайшие направления

Горы Северной Джорджии130 км © 2021 Airbnb, Inc.